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Cloruro de litio para luchar contra la Varroa

Published on 29/08/2018 under Blog
Cloruro de litio para luchar contra la Varroa

El cloruro de litio mata eficazmente al parásito de la abeja melífera Varroa destructor mediante un modo de acción sistémico

Otro artículo publicado con anterioridad sobre el cloruro de litio aplicado como tratamiento contra Varroa: Un descubrimiento accidental podría salvar a las abejas de su mayor amenaza, publicado el 17/01/2018

Autores: Bettina Ziegelmann (1) Elisabeth Abele (1) Stefan Hannus (2) Michaela Beitzinger (2) Stefan Berg (3) y Peter Rosenkranz (1). Artículo original: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5766531/

Las abejas son cada vez más importantes en la polinización de cultivos y plantas silvestres. Su valor para el ecosistema radica en el hecho de que las abejas melíferas polinizan más del 90% de las plantas polinizadas por insectos y, al ser generalistas, son cruciales para las redes de polinización. Informes recientes sobre el debilitamiento y altas pérdidas periódicas de colonias de abejas melíferas han alarmado a los apicultores, agricultores y científicos. Las altas pérdidas de colonias no sólo agravan el manejo de las colonias de abejas melíferas, sino que también aumentan significativamente los costos de los servicios de polinización, con consecuencias para la producción mundial de cultivos.

Aunque las razones de los problemas actuales de la salud de las abejas melíferas no se han aclarado por completo, el ácaro ectoparasitario chupador de hemolinfa, Varroa destructor, se considera un impulsor crucial de esta situación global de las colonias de abejas melíferas.

La diferencia más llamativa entre la transmisión de virus por alimentación y por contacto entre abejas dentro de una colonia y por Varroa es que, el ácaro inyecta directamente el virus en la hemolinfa, lo que conduce a un by-pass de los mecanismos de defensa del huésped. Las prácticas de apicultura migratorias y las altas densidades de colonias han agravado aún más el problema, al favorecer la transmisión horizontal de virus de abejas entre colonias vecinas a través del vector de ácaros. Este escenario ha propiciado una mayor prevalencia de cepas más virulentas de virus de abejas melíferas, con la consecuencia de que el daño para las colonias de abejas melíferas infestadas de ácaros ha recido imparablemente en los últimos 20 años.

Infestaciones con el ácaro ectoparasitario Varroa destructor, en combinación con sus virus asociados, se han identificado como un factor crucial en la mortalidad de las abejas. Aunque se requieren tratamientos anuales para evitar el colapso de las colonias, el número de acaricidas efectivos es pequeño y no se han registrado nuevos compuestos activos en los últimos 25 años. Los métodos basados ​​en RNAi se propusieron recientemente como una nueva herramienta prometedora. Sin embargo, la aplicación de estos métodos de acuerdo con los protocolos publicados ha llevado a un descubrimiento sorprendente. Aquí, mostramos que el cloruro de litio, y otros compuestos de litio, que se usó para precipitar el ARN es altamente efectivo para matar a los ácaros Varroa, cuando se alimentan a las abejas huésped con bajas concentraciones de milimolares. Experimentos con abejas enjauladas y enjambres artificiales sin crías, que consisten en una reina y varios miles de abejas, demuestran claramente el potencial del litio como agente miticida, con buena tolerabilidad en abejas obreras, proporcionando una base prometedora para el desarrollo de un control efectivo y fácil de aplicar método para el tratamiento de ácaros.

Bajo las condiciones de la práctica apícola común, en regiones no tropicales, que se caracterizan por altas densidades de colonias, prevención de enjambres y control periódico de ácaros, parece difícil lograr una relación huésped-parásito más equilibrada. Hasta el momento, una supervivencia a largo plazo de colonias de A. mellifera, sin ninguna medida de control, puede darse casi exclusivamente de poblaciones salvajes o de colonias sometidas continuamente a la presión de la selección natural.

En la mayoría de los casos, no está claro si esta supervivencia se debe a la tolerancia, al limitar el daño al huésped, o más bien a los mecanismos de resistencia al reducir el éxito reproductivo del parásito. A pesar de los enfoques prometedores, parece bastante dudoso que las medidas de tratamiento actuales resolverán el problema global de la Varroa en el futuro. Por lo tanto, casi todas las colmenas requieren uno o dos tratamientos anuales y es muy probable que esto sea aún más necesario en las próximas décadas.

Teniendo en cuenta este desafío para la apicultura mundial, es alarmante que todos los productos veterinarios sintéticos, actualmente registrados para el control de Varroosis, se basen en unos pocos compuestos, es decir, el organofosfato de cumafos, algunos piretroides y la formamidina amitraz. No se han registrado nuevos compuestos activos durante más de 25 años. Como consecuencia, los ácaros Varroa han desarrollado resistencia a todos los acaricidas sintéticos disponibles. El uso alternativo de ácidos orgánicos y aceites esenciales desafortunadamente ha dado como resultado una eficacia variable e inconsistente. A pesar de una mayor atención para Varroa, se siguen reportando pérdidas periódicas de colonias en casi todos los países de Europa y América del Norte. Esto demuestra claramente que se necesitan con urgencia más actividades de investigación sobre el tratamiento con Varroa para desarrollar agentes novedosos y más eficaces contra la Varroosis.

Recientemente, Garbian et al . reportaron un nuevo enfoque, con el uso de RNAi para controlar la infestación de Varroa. Brevemente, el ARN bicatenario (dsRNA) que combina los genes esenciales de Varroa se transfirió horizontalmente a los ácaros que parasitan a las abejas a través de la hemolinfa ingerida. El enfoque utiliza elegantemente el organismo huésped como vector para entregar los dsRNAs letales y selectivos al parásito. De hecho, los autores muestran que en Varroa , dsRNA derriba los genes específicos y conduce a la pérdida de ácaros de hasta 60% en 2 meses. Intrigados por este enfoque, se propuso mejorar el método con una mayor actividad y un período de tratamiento más corto.

Resultados y discusión

Estudio piloto: de RNAi a cloruro de litio

En un estudio piloto, las abejas melíferas infestadas de ácaros fueron enjauladas y alimentadas con jarabe de sacarosa que contiene dsRNAs de genes Varroa potencialmente esenciales (Tabla S1 complementaria  ). El jarabe de sacarosa simple (no tratado) y el jarabe con ARNds basado en la secuencia de codificación para la proteína fluorescente verde GFP (dsGFP ctrl) sirvieron como controles. GFP se expresa en la medusa bioluminiscente hidrozoo Aequorea victoria . La secuencia de GFP se eligió como control porque no existe gen homólogo en el genoma de las abejas melíferas ni en el ácaro Varroa . En el grupo no tratado, la mortalidad de los ácaros fue <5%. Por el contrario, todos los ácaros de las abejas que recibieron solución de sacarosa que contiene dsRNA dirigido a Varroa los genes se mataron efectivamente dentro de los tres días. Sin embargo, se observó un efecto idéntico sobre los ácaros en un experimento de control en el que las abejas se alimentaron con dsRNA de GFP (Fig. S1 suplementaria  ).

Estos resultados descartaron el mecanismo propuesto de ARNi pero sugirieron un efecto aún desconocido del ARN o la actividad de otros componentes en la solución de prueba. Como se utilizaron altas concentraciones de cloruro de litio (LiCl) en la producción de dsRNAs y, por lo tanto, se alimentaron a las abejas junto con el dsRNA, elegimos alimentar LiCl en solución de sacarosa a las abejas enjauladas para evaluar su actividad contra Varroa. Sorprendentemente, el LiCl a concentraciones de 25 mM, que corresponde a la concentración calculada en la solución de dsRNA, mató a los ácaros tan eficazmente como las sustancias de prueba que contienen dsRNA. Además, después de que el LiCl se eliminó en gran medida de dsRNA por lavado extensivo, la actividad miticida se disminuyó sustancialmente como se indicó por inicio retrasado y actividad reducida (Fig. S1 suplementaria  ). A partir de estos datos, llegamos a la conclusión de que el LiCl, no el silenciamiento del ARN, mediaba la actividad observada en los ácaros Varroa y que valdría la pena analizar el potencial del LiCl como un varroacidio.

Concentración efectiva de cloruro de litio

Para corroborar las observaciones principales de nuestro estudio piloto, establecimos experimentos en jaulas con diferentes concentraciones de LiCl para un análisis estadístico sólido. Además de la concentración de 25 mM, que se encontró que era efectiva en el estudio piloto, utilizamos concentraciones de 2 mM, 4 mM y 10 mM para determinar el umbral de eficacia más bajo. Los resultados respaldaron los hallazgos del estudio anterior y demostraron efectos miticidas significativos para concentraciones de LiCl tan bajas como 2 mM en las cuales hubo un aumento sustancial en la mortalidad de ácaros ( P  <0.001, prueba de log-rank; Tabla S2 complementaria). ) fue mostrado. Concentraciones más altas de 10 mM y 25 mM aumentaron significativamente la mortalidad de ácaros comenzando en el día dos de tratamiento y lograron la exterminación de más del 96% de los ácaros tratados al final del experimento (Fig.  1a , Tabla Suplementaria  S2 ). En los experimentos de control sin LiCl en la solución de alimentación, la mortalidad de los ácaros alcanzó un promedio del 9,3% y, por lo tanto, estaba dentro del rango de tasas de mortalidad obtenidas para los ácaros mantenidos en abejas no tratadas en condiciones ambientales diferentes  . En base a estos resultados, confirmamos un efecto claro del LiCl sobre la viabilidad de los ácaros en un rango de concentración entre 2 mM y 25 mM.

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es 41598_2017_19137_Fig1_HTML.jpg

Figura 1

Mortalidad de ácaros Varroa y abejas melíferas después de alimentar a las abejas enjauladas con cloruro de litio (LiCl). ( a ) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de ácaros hembra Varroa mantenidos en abejas enjauladas alimentadas con LiCl en concentraciones entre 2 mM-25 mM (n = 33, 9, 9, 12 y 9 jaulas para 0 mM (control), 2 mM , 4 mM, 10 mM y 25 mM, respectivamente). En todas las concentraciones, la supervivencia de los ácaros en los grupos de tratamiento fue significativamente diferente del control ( P  <0.001, prueba de log-rank con corrección de Bonferroni). ( b ) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de abejas obreras enjauladas y Varroa hembraácaros después de 24 h de exposición a LiCl (n = 9 jaulas). La supervivencia de los ácaros en el grupo de tratamiento fue significativamente diferente del grupo de control ( P  <0.001, prueba de rango logarítmico) pero no hubo diferencias significativas entre los grupos en la mortalidad de las abejas.

En estos experimentos, las abejas enjauladas se alimentaron con la concentración respectiva de LiCl durante varios días hasta que el tratamiento eliminó a todos los ácaros. Sin embargo, para un posible uso en la práctica de la apicultura, sería preferible un período de tratamiento más corto y definido. Por lo tanto, realizamos un experimento adicional, en el que se administró la concentración más efectiva de LiCl 25 mM (figura  1a ) durante 24 h seguido de alimentación con solución de azúcar durante seis días adicionales. Al final del período de observación, el 92,9% de los ácaros (n = 225 ácaros, P  <0,001, prueba de log-rank) se sacrificaron sin ningún efecto significativo sobre las abejas tratadas (véase el párrafo siguiente). Este resultado demuestra claramente que incluso una alimentación a corto plazo de LiCl 25 mM es suficiente para disminuir sustancialmente la población de ácaros.

Para determinar con precisión la cantidad ingerida de LiCl por las abejas que es necesaria para matar a los ácaros, 12 abejas recién eclosionadas se alimentaron artificialmente con 10 μl de soluciones de LiCl de 4 mM a 100 mM y se mantuvieron individualmente con un ácaro phoretic durante cinco días dentro de las jaulas. Con las soluciones 4 mM y 10 mM, que correspondieron a una absorción de 1.7 μg y 4.2 μg de LiCl, respectivamente, el efecto no fue significativamente diferente del control no tratado (n = 12 ácaros, P = 1.000, prueba de log-rank, Tabla Suplementaria  S3 ). Sin embargo, una sola dosis de 25 mM, que corresponde a 10,6 μg de LiCl consumido por la abeja, fue suficiente para matar el 100% de los ácaros de la fiebre en 48 horas (Fig.  2 ).

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es 41598_2017_19137_Fig2_HTML.jpg

La mortalidad de los ácaros Varroa póricos se mantuvo en las abejas que se alimentaron individualmente con 10 μl de una solución de cloruro de litio a concentraciones que oscilaban entre 4 mM y 100 mM. Las abejas fueron alimentadas con LiCl una sola vez al comienzo del experimento, luego recibieron jarabe de sacarosa durante cinco días. Para cada concentración, se analizaron 12 jaulas con una abeja y un ácaro de Varroa . La supervivencia de los ácaros se redujo significativamente en comparación con el grupo control cuando se administraron concentraciones de 25 mM y superiores a las abejas ( P  <0,001, prueba de rango logarítmico).

Efecto sobre las abejas obreras

Para el análisis de la tolerabilidad del LiCl a las abejas obreras, las jaulas de prueba que se utilizaron para analizar la mortalidad de los ácaros (Figura  1a ) se registraron adicionalmente para la mortalidad de las abejas obreras. Después de la exposición a 2 mM, 10 mM y 25 mM de LiCl que se ha demostrado que ejercen actividad miticida, la mortalidad de las abejas obreras tratadas varió en promedio de 3 a 7% dentro de los diferentes grupos de alimentación. Con la excepción del grupo LiCl 10 mM (n = 12 jaulas, P  = 0.015, prueba de log-rank; Tabla S4 complementaria  ), los valores no fueron significativamente diferentes de la mortalidad del 4% en el grupo de control no tratado. Además, las tasas de mortalidad de nuestros controles estuvieron dentro del rango de la mortalidad de las abejas de jaula no tratadas requeridas como control en las pruebas de toxicología , por lo tanto confirmando la validez de nuestro sistema de prueba. Además, el tratamiento de 24 horas con LiCl no afectó la mortalidad de las abejas obreras (Fig. 1b ; n = 9 jaulas,P = 0,308, prueba de log-rank). Una buena tolerabilidad de LiCl para las abejas también se confirmó mediante la administración de una dosis única (para la mortalidad de ácaros en la Fig. 2 ) que no provocó un aumento significativo en la mortalidad de abejas obreras (P = 1.000, prueba de log-rank; Tabla S5complementaria )

A continuación, se alimentaron continuamente diferentes concentraciones de LiCl hasta que la última abeja enjaulada murió para investigar la respuesta a la exposición a largo plazo. Aquí, el tratamiento redujo significativamente la vida promedio de las abejas obreras recién nacidas de 26 días en las jaulas de control no tratadas a 23 y 22 días para LiCl 2 mM y 10 mM, respectivamente (n = 60 abejas, P  = 0.024, prueba de rango logarítmico ; Tabla S6 complementaria  ). En las abejas que recibieron la mayor concentración de LiCl 25 mM, la vida útil se redujo significativamente a 19 días en promedio (Figura  3a ).

Un archivo externo que contiene una imagen, ilustración, etc. El nombre del objeto es 41598_2017_19137_Fig3_HTML.jpg

Mortalidad de las abejas después de alimentar a las abejas enjauladas con cloruro de litio. ( a ) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de abejas obreras enjauladas durante la exposición crónica al LiCl. Las dietas de LiCl a concentraciones de 2 mM, 10 mM y 25 mM se alimentaron ad libitum hasta la muerte de la última abeja (n = 6 jaulas con 10 abejas cada una). La supervivencia de todos los grupos tratados fue significativamente diferente del control de jarabe de azúcar ( <  0.01, prueba de rango logarítmico con corrección de Bonferroni). ( b) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de abejas obreras enjauladas después de una exposición a LiCl de 24 horas. Las dietas de LiCl a concentraciones de 2 mM, 10 mM y 25 mM fueron alimentadas ad libitum durante las primeras 24 h después de la eclosión y luego reemplazadas por jarabe de sacarosa (n = 12 jaulas con 10 abejas cada una). La supervivencia de todos los grupos tratados no fue significativamente diferente del control de jarabe de azúcar ( P  > 0.1, prueba de log-rank con corrección de Bonferroni).

Sin embargo, el LiCl parece impedir la viabilidad de la abeja solo si se administra durante un período prolongado de tiempo como lo indica un experimento adicional en el que se alimentó LiCl durante las primeras 24 h después de la eclosión y luego se reemplazó por jarabe de sacarosa hasta que murió la última .  3b ). Aquí, el promedio de vida de las abejas obreras recién nacidas varió de 22 días (10 mM) a 24 días (control) sin diferencias significativas entre los tratamientos (n = 120 abejas por tratamiento, P  ≥ 0.126, prueba de log-rank; Tabla S7 complementaria)  ) Con base en estos datos de las abejas enjauladas, concluimos que incluso un tratamiento con LiCl a corto plazo es suficiente para erradicar por completo a Varroainfestación de ácaros con poco o ningún impacto sobre la viabilidad de las abejas obreras. Estos resultados obtenidos en pruebas de jaula bajo condiciones controladas representan un primer paso exitoso y prometedor hacia un nuevo enfoque para el tratamiento con Varroa . Sin embargo, la eficacia y los efectos secundarios deben confirmarse en condiciones de campo.

Pruebas de campo con cloruro de litio en enjambres artificiales

Para aproximar las condiciones del campo, probamos 25 mM y 50 mM de LiCl en nueve enjambres artificiales sin crías que consisten en una reina y aproximadamente 20,000 abejas cada una. Estas concentraciones se eligieron en base a experimentos previos con abejas enjauladas utilizando la dosis más alta que todavía era tolerada por las abejas en tiempos de aplicación cortos (25 mM). Debido a que una distribución uniforme de jarabe de sacarosa en todo el enjambre artificial de aproximadamente 20,000 abejas podría haber sido difícil de lograr, adicionalmente probamos una concentración 50 mM de LiCl para asegurar que cada abeja estuviera expuesta a cantidades suficientes de litio. En consecuencia, los enjambres fueron alimentados ad libitumcon jarabe de sacarosa que contiene LiCl 25 mM (n = 6) o 50 mM (n = 3) durante un período de tres días, seguido de una aplicación tópica de Perizin®. Perizin® que contiene el organofosfato de cumafos como ingrediente activo, es un varroacide altamente efectivo que se usa comúnmente como tratamiento de control  . La mortalidad de ácaros fue monitoreada durante un período de cinco días. Antes del tratamiento de control, el LiCl 25 mM eliminó aproximadamente el 90% de los ácaros presentes en los enjambres artificiales (Tabla  1 ). La solución más concentrada (50 mM), sin embargo, no aumentó este efecto (prueba χ2, P = 0.953). En conjunto, la eficacia fue algo menor en comparación con las pruebas de jaula. Una explicación podría ser que la distribución de LiCl dentro de un grupo de miles de abejas requiere más tiempo hasta que la última abeja individual consuma una dosis suficiente para matar a los respectivos ácaros parásitos. El tiempo de alimentación necesario de tales entidades enormes de 20,000 abejas y más se debe analizar en experimentos adicionales.

tabla 1

Comparación de la acción varroacida de dos dietas de cloruro de litio administradas a enjambres artificiales durante cinco días.

Concentración de cloruro de litio Caída de ácaros [Media ± SD]
Enjambres [n] Tratamiento con LiCl Tratamiento Perizin Eficacia [%]
25 mM 6 562.5 ± 149.4 65.5 ± 26.9 88.9
50 mM 3 178.3 ± 49.7 22.3 ± 3.1 89.6

Se presenta la caída media del ácaro después del cloruro de litio y los tratamientos finales con Perizin y la eficacia calculada del tratamiento con litio. Las diferencias entre los dos tratamientos con cloruro de litio no fueron significativas (prueba de χ2, P  = 0,953).

Eficacia de otros compuestos de litio y sales distintas de litio

Para confirmar que el litio es el componente activo del efecto en Varroaácaros probamos una serie de compuestos de litio y comparamos los efectos miticidas con sales que no son de litio. De particular interés fueron el citrato de litio, un compuesto con tres iones de litio, sulfato de litio y carbonato de litio, que tienen dos iones de litio en comparación con un solo ion de litio en LiCl. Se incluyeron compuestos adicionales con un ion de litio (lactato de litio, acetato de litio), pero con diferente solubilidad, reactividad química y precio para analizar la eficacia y tolerabilidad en comparación con LiCl. En experimentos en jaulas, todos los compuestos eliminaron el 100% de los ácaros a 25 mM en tres (citrato de litio y acetato de litio) a cuatro días (sulfato de litio, lactato de litio y carbonato de litio). Además, las soluciones de prueba de 4 mM, ácaros phoretic completamente matados dentro de cinco (citrato de litio, sulfato de litio, 2 ; Tabla Suplementaria  S8 ).

Tabla 2

Mortalidad de ácaros Varroa y abejas obreras después de alimentar dos concentraciones de diferentes compuestos de litio durante un período máximo de alimentación de siete días.

Controlar Sulfato de litio Lactato de litio Acetato de litio Citrato de litio Carbonato de litio
4 mM 25 mM 4 mM 25 mM 4 mM 25 mM 4 mM 25 mM 4 mM 25 mM
Jaulas (n) 33 3 3 3 6 3 3 3 3 3 3
Mortalidad de ácaros (% ± SD) 9.4 (± 6.2) 100 100 100 100 100 100 100 100 94.7 (± 9.2) 100
Mortalidad de abejas (% ± SD) 3.3 (± 4.2) 4 (± 2) 12.7 (± 7) 4.7 (± 2.3) 10 (± 3.5) 9.3 (± 4.2) 5.3 (± 5.8) 5.6 (± 6.9) 6 (± 6) 2 3.3 (± 4.2)

La mortalidad de las abejas obreras no aumentó significativamente en ninguna concentración en comparación con las abejas de control no tratadas, a excepción de 25 mM de sulfato de litio y 25 mM de lactato de litio (Tabla S9 complementaria  ). Con estos experimentos podríamos confirmar que otros compuestos de litio tienen un potencial similar para el uso como acaricida sistémico. Esto podría aumentar la flexibilidad para el posible diseño de un producto veterinario. Teniendo en cuenta el precio, el cloruro de litio y el citrato de litio son los compuestos más baratos. El sulfato de litio es menos adecuado debido a la menor tolerabilidad de las abejas y al carbonato de litio debido a una solubilidad en agua relativamente baja.

Para investigar la eficacia dependiente de la concentración de compuestos de litio con más detalle, comparamos LiCl con citrato de litio (Li 3 C 6 H 5 O 7 ), que tuvo la mayor diferencia en el número de iones de litio por molécula, en cinco concentraciones diferentes en un rango de 1 mM-25 mM. Todas las concentraciones de citrato de litio mostraron una actividad acaricida significativamente mayor en comparación con el LiCl, pero no hubo diferencia en la mortalidad de las abejas (Tabla  3 , Tablas complementarias  S9 y S11 ). Por lo tanto, el citrato de litio podría representar un ingrediente activo aún mejor.

Tabla 3

Comparación de la eficacia y los efectos secundarios de LiCl y citrato de litio usando concentraciones de 1 mM a 25 mM durante un período máximo de alimentación de siete días.

Concentración Cloruro de litio Citrato de litio
Jaulas (n) Mortalidad de abejas (%) Mortalidad de ácaros (%) Jaulas (n) Mortalidad de abejas (%) Mortalidad de ácaros (%)
1 mM 6 1 29 3 3 48
2 mM 9 3 72 6 4 96
4 mM 9 4 53 6 6 100
10 mM 12 7 96 6 4 100
25 mM 9 5 100 3 6 100

Como un control libre de litio y para descartar el cloruro como un agente activo también probamos las sales alcalinas cloruro de sodio (NaCl) y cloruro de potasio (KCl) y también cloruro de magnesio (MgCl) a 25 mM. No observamos un efecto varroacidal para NaCl o KCl (n = 3 jaulas, P = 1.000, prueba de rango logarítmico, Tabla Suplementaria  S12 ). En pruebas con MgCl, el 100% de las abejas enjauladas murieron dentro de los cinco días (P <0.001, prueba de rango logarítmico), y de acuerdo con la disminución del número de abejas, el experimento finalizó antes de poder analizar el efecto sobre los ácaros. Con base en estos experimentos, concluimos que el litio de hecho media la actividad acaricida de una manera dependiente de la dosis y que el citrato de litio exhibe las propiedades más favorables de todos los compuestos probados hasta el momento.

Potencial de compuestos de litio como nuevo varroacidio

Hemos demostrado que no los ARN de doble cadena inicialmente formulados contra los genes esenciales de Varroa pero sorprendentemente las sales de litio median un fuerte efecto acaricida sobre los ácaros Varroa en abejas enjauladas y en enjambres artificiales. Por lo tanto, estos resultados muestran que los compuestos de litio representan una nueva clase de agentes acaricidas con un potencial sobresaliente y una tolerabilidad notablemente buena por las abejas. La diferente susceptibilidad de los ácaros y las abejas al LiCl es aún más notable si se tiene en cuenta que debido a los efectos de dilución, la concentración de LiCl en la hemolinfa de las abejas probablemente será sustancialmente menor que la concentración suministrada a las abejas.

Es importante destacar que nuestros hallazgos no implican que los efectos acaricidas de los enfoques basados ​​en ARNi publicados por Garbian et al .  están generalmente mediados por LiCl. Después de la alimentación de una mezcla de dsRNA a las abejas melíferas durante un período de 60 días, Garbian et al .  registraron un lento aumento en la mortalidad de ácaros con una eficacia final del tratamiento de solo el 60%. En vista de la respuesta rápida y altamente efectiva de nuestros enjambres artificiales a los tratamientos con LiCl, son posibles diferentes modos de acción: mientras que los efectos mediados por RNAi parecen ejercer efectos a largo plazo, los compuestos de litio representan un mecanismo independiente de rápido inicio y alta eficacia.

Como un varroacide, LiCl muestra algunas características que son únicas en esta combinación: (i) El LiCl actúa sistémicamente a través de la alimentación de abejas melíferas (“fácil de aplicar”), (ii) es soluble en agua y por lo tanto no se acumulará en la cera de abejas es un problema crucial para los conceptos de tratamiento a largo plazo que usan varroacidios sintéticos con propiedades lipofílicas  ,  (iii) la toxicidad oral de la mayoría de los compuestos de litio para los mamíferos es relativamente baja  (iv) no tiene efecto repelente sobre la solución de alimentación rango de concentración de 2-25 mM y (v) está disponible a precios moderados. Muy prometedor es el hecho de que una sola aplicación de solo 10 μl de LiCl en una solución 25 mM (que corresponde a una dosificación de 10,6 μg de LiCl) por cada abeja individual es suficiente para matar los ácaros fóréticos. Un desafío para futuras investigaciones será el desarrollo de una técnica de aplicación inteligente para enjambres y colonias de tamaño completo para asegurar que todas las abejas reciban la cantidad crítica del compuesto activo.

Actualmente, no sabemos cómo el LiCl está matando a los ácaros varroa póricos, y hay pocas publicaciones sobre el efecto del LiCl en los insectos  . En medicina humana, el litio se ha utilizado desde la década de 1870 y es un agente estabilizador del estado de ánimo indicado para el tratamiento de episodios maníacos y como tratamiento de mantenimiento para el trastorno bipolar  . En vista de su uso terapéutico, los compuestos de litio y su perfil de toxicidad se han investigado cuidadosamente. Hasta ahora, varias enzimas que actúan sobre el metabolismo, el desarrollo, la hematopoyesis y otros procesos se han propuesto como objetivos potenciales  , . Estas enzimas requieren iones metálicos y el litio ejerce su actividad de manera no competitiva, lo que muy probablemente ocurre al desplazar un catión divalente. Es cierto que actualmente no tenemos ninguna indicación de que el efecto miticida observado de los compuestos de litio se base en un modo de acción comparable.

También somos conscientes del hecho de que nuestros resultados representan solo el primer paso hacia el desarrollo de un nuevo producto veterinario. Las pruebas de campo en colonias de vuelo libre son tan necesarias como el análisis de los efectos colaterales subletales ya largo plazo en las crías de abejas adultas y abejas melíferas y posibles problemas de residuos en la miel.

Sin embargo, los resultados presentados aquí indican que ya LiCl tiene potencial como un tratamiento eficaz y fácil de aplicar para enjambres artificiales y naturales, y en particular para el gran número de paquetes de abejas para la polinización utilizados en los Estados Unidos  ,  . Además, la elucidación del mecanismo de acción podría abrir nuevas vías para el desarrollo específico de productos veterinarios para combatir los ácaros Varroa .

Métodos

Configuración general de las pruebas de jaula

El efecto de cloruro de litio, otras sales de litio y sales de control de Varroa ácaros se alimentan de las abejas tratadas se evaluó en pruebas de jaula  que consisten en envases de 600 ml de plástico. Se colocó una base de cera (9 cm × 3,5 cm) en el medio del recipiente y se perforó un agujero para una jeringa de alimentación de 10 ml (Injekt®, Roth) en el fondo (Fig. S2 complementaria  ). La jaula se dio la vuelta y se cerró con medias en lugar de la tapa de plástico. Se realizaron experimentos de alimentación de dosis única y longevidad en recipientes de 40 ml (Rotilabo®, Roth) equipados con medias y jeringas de alimentación de 10 ml (Injekt®, Roth). Las abejas melíferas se originaron en colonias con baja Varroaniveles de infestación y se obtuvieron de peines de cría que contienen larvas de abeja L5 (quinto estadio larvario). Para los experimentos sobre la duración total de vida de las abejas obreras y para la aplicación de dosis única, se usaron abejas recién nacidas de los panales de cría mantenidos en una incubadora. Se recolectaron ácaros Varroa hembra de colonias fuertemente infestadas utilizando el método del azúcar glasé , lavar con agua tibia y secar antes de transferir a las abejas enjauladas. Tan pronto como todas las jaulas estuvieron equipadas con ácaros y abejas melíferas, las jeringas de alimentación se llenaron con la solución de alimentación de prueba o control (Apiinvert®, Südzucker, contenido de sustancia seca: 30% de sacarosa, 31% de glucosa, 39% de fructosa) y las jaulas se almacenaron en una incubadora oscura (Memmert, 27 ° C, 60% HR). Los individuos muertos fueron contados y eliminados diariamente, luego la solución de alimentación fue reemplazada.

Estudio piloto: de RNAi a cloruro de litio

En un primer paso, utilizamos la bioinformática para identificar los genes esenciales de Varroa . Las secuencias derivadas de los contigs publicados de Varroa destructor se lanzaron contra los genomas anotados de Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans . En un paso posterior se seleccionaron secuencias que se mostraron esenciales en estos organismos. En base a la homología con estas secuencias esenciales, seleccionamos 12 genes (Rpn1, Rpn3, Noi, GC2807, RPL7, ATP syn-beta, AlphaTub 84B, His2B, Med, RPL15, Blw y So) en el genoma de Varroa con alta probabilidad de impacto viabilidad de los ácaros después de la caída mediada por ARNi (Tabla Suplementaria  S1 ).

Para obtener ARN, los ácaros de Varroa se congelaron en nitrógeno líquido y se homogeneizaron usando un mortero y una mano de mortero. El ARN se aisló usando Tri-Reagenz (Sigma Aldrich) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 1 μg de ARN se utilizó para la síntesis de ADNc (kit BioRad iScript) en un volumen de reacción de 20 μl, y se usaron 0,5 μl de ADNc para la reacción de PCR. Cada PCR se realizó con cebadores específicos del gen Varroa con una secuencia de cebador de polimerasa T7 adicional en el extremo 5 ‘para permitir la transcripción del ARN dependiente de ARN polimerasa T7. Para cada gen, se realizaron dos PCR: una con un sitio de cebador T7 para la cadena con sentido y una con un sitio de cebador T7 para la cadena antisentido. Este paso se realizó para permitir la transcripción in vitroespecífica de cadena de cada gen. Despuéstranscripción in vitro , el ARN se precipitó usando una concentración final de LiCl 2,5 M. El sobrenadante se eliminó por completo, y el ARN se disolvió en agua libre de ARNasa. Los transcritos de ARN de sentido y antisentido se mezclaron juntos en concentraciones equimolares y se hibridaron calentando 5 min a 95 ° C seguido de enfriamiento lento hasta ~ 50 ° C. El RNA recocido (dsRNA) estaba entonces listo para usar en las pruebas de jaula.

Por jaula, 100 abejas melíferas se infectaron con 30 ácaros Varroa y se alimentaron con jarabe de azúcar que contenía 0,8 μg de dsRNA por gen, abeja y día. Por consiguiente, se alimentó diariamente un total de 960 μg de dsRNA. Además del jarabe de azúcar, una cantidad similar de dsRNA basada en la secuencia codificante de la proteína fluorescente verde GFP (dsGFP ctrl) sirvió como control (n = 3 jaulas cada uno). En experimentos sucesivos, se alimentó a las abejas jarabe de azúcar que contenía dsGFP lavada (n = 1 jaula) y LiCl a una concentración de 25 mM (n = 2 jaulas). Las abejas recibieron la dieta correspondiente durante todo el período de observación de cuatro días.

Concentración efectiva de cloruro de litio

El efecto acaricida del cloruro de litio (Roth ≥ 99%) se evaluó mediante la administración de cinco concentraciones de una solución de jarabe de azúcar / cloruro de litio que variaba de 1 mM a 25 mM a abejas melíferas infestadas (n = 6, 9, 9, 12 y 9 jaulas para 1 mM, 2 mM, 4 mM, 10 mM y 25 mM, respectivamente). Por jaula 50 (± 2) abejas y 25 (± 2) Varroalos ácaros fueron utilizados. Tan pronto como murieron todos los ácaros, la solución de prueba fue sustituida por jarabe de azúcar. Después de siete días, las abejas y los ácaros restantes fueron muertos por congelación y contados. El período experimental de siete días se utilizó aquí porque con las dos concentraciones más efectivas de 10 mM y 25 mM ya murieron todos los ácaros dentro de este período de tiempo y no intentamos probar los efectos de una aplicación crónica sobre la mortalidad de ácaros. Para una prueba de supervivencia a largo plazo de las abejas obreras, se usaron períodos de tiempo más largos (ver a continuación). Para una comparación de LiCl con un compuesto con tres iones de litio, se probó el citrato de litio (Roth ≥ 98% Ph. Eur) en el mismo rango de concentración (n = 3, 6, 6, 6 y 3 jaulas para 1 mM, 2 mM, 4 mM, 10 mM y 25 mM, respectivamente).

Además, probamos el efecto de un tratamiento a corto plazo alimentando cloruro de litio 25 mM solo durante 24 horas (n = 9 jaulas). Posteriormente, la solución de alimentación con cloruro de litio fue reemplazada por Apiinvert® durante seis días más.

Para definir la dosis crítica que mata efectivamente a los ácaros Varroa , las abejas recién nacidas se alimentaron individualmente después de un período de hambre de 3 horas con 10 μl de jarabe de azúcar o 10 μl de una solución de cloruro de litio / sacarosa de 4 mM a 100 mM . Por concentración 12 abejas fueron alimentadas y mantenidas individualmente. Cada abeja melífera fue infestada con un ácaro varroaprefórico directamente después de la alimentación manual y recibió una dieta de jarabe de azúcar durante el siguiente período de observación de cinco días.

Efecto sobre las abejas obreras

La longevidad de las abejas melíferas alimentadas con cloruro de litio se probó en pruebas de jaula separadas que contenían jarabe de azúcar o una solución de cloruro de litio a concentraciones de 2 mM, 10 mM y 25 mM (n = 6 jaulas cada una). Cada jaula contenía 10 abejas recién nacidas que fueron constantemente alimentadas con la solución respectiva hasta que todas las abejas murieron.

Pruebas de campo con cloruro de litio en enjambres artificiales

Para aproximar las condiciones naturales, probamos la actividad acaricida del cloruro de litio en enjambres artificiales sin cría  . Por lo tanto, 9 enjambres artificiales con aproximadamente 2 kg de abejas cada una y una reina enjaulada se colocaron en cajas cerradas y se mantuvieron a 15 ° C en la oscuridad. Después de establecerse, los enjambres artificiales se alimentaron con jarabe de sacarosa con 25 mM (n = 6) o 50 mM (n = 3) de cloruro de litio a través de un contenedor durante tres días. Después del tratamiento, todos los enjambres fueron transferidos de las cajas a las colmenas en un apiario y se les permitió forrajear. Los alimentos fueron provistos ad libitum y la mortalidad de los ácaros fue monitoreada diariamente. Los ácaros restantes se eliminaron usando 50 ml de Perizin® por enjambre por goteo y recuento posterior de los ácaros durante un período de dos días.

Eficacia de otros compuestos de litio y sales distintas de litio

Probamos además citrato de litio (Roth ≥ 98% Ph. Eur), sulfato de litio (Roth ≥ 99%), carbonato de litio (Roth ≥ 99%), acetato de litio (Roth ≥ 99%) y lactato de litio (Sigma Aldrich 95%) a concentraciones de 4 y 25 mM (n = 3 jaulas cada uno). En las pruebas de control, las abejas enjauladas fueron alimentadas solo con Apiinvert® (n = 33 jaulas). Como control adicional, cloruro de magnesio (Roth ≥ 98,5%) y las sales alcalinas cloruro de potasio (Roth ≥ 99%) y cloruro de sodio (Roth ≥ 99%) se alimentaron de la misma manera a una concentración de 25 mM (n = 3 jaulas cada uno). Para una comparación detallada con LiCl, el citrato de litio se probó en concentraciones adicionales. Todas las pruebas de jaula se realizaron de la misma manera que se describe en “Concentración efectiva de cloruro de litio”.

Estadística

Los conjuntos de datos obtenidos de las pruebas de jaula se analizaron mediante el software de estadísticas SPSS 22. Se estimó una distribución de supervivencia a partir de los tiempos de muerte continua de los ácaros Varroa y las abejas melíferas mediante la realización de una estimación de supervivencia de Kaplan-Meier. La supervivencia entre los tratamientos se comparó por pares y se probó su importancia con pruebas de log-rank seguidas de una corrección de Bonferroni. Se utilizó una prueba de chi-cuadrado para comparar los datos de caída de ácaros de enjambres artificiales tratados con dos concentraciones diferentes de cloruro de litio. Las diferencias entre los grupos con P  <0.05 se consideraron estadísticamente significativas.

Notas a pie de página

Una corrección a este artículo está disponible en línea en https://doi.org/10.1038/s41598-018-21311-2 .

Referencias

1. Lautenbach S, Seppelt R, Liebscher J, Dormann CF. Spatial and Temporal Trends of Global Pollination Benefit. PLoS ONE. 2012;7(4):e35954. doi: 10.1371/journal.pone.0035954. [PMC free article] [PubMed][Cross Ref]
2. Potts SG, et al. Global pollinator declines: trends, impacts and drivers, 2010. Trends in Ecology and Evolution. 2010;25(6):345–353. doi: 10.1016/j.tree.2010.01.007. [PubMed] [Cross Ref]
3. Calderone NW. Insect Pollinated Crops, Insect Pollinators and US Agriculture: Trend Analysis of Aggregate Data for the Period 1992–2009. PLoS One. 2012;7(5):e37235. doi: 10.1371/journal.pone.0037235. [PMC free article] [PubMed] [Cross Ref]
4. Le Conte Y, Ellis M, Ritter W. Varroa mites and honey bee health: can Varroa explain part of the colony losses? Apidologie. 2010;41:353–363. doi: 10.1051/apido/2010017. [Cross Ref]
5. Dietemann V, et al. Varroa destructor: research avenues towards sustainable control. J. Apicult. Res. 2012;51:125–132. doi: 10.3896/IBRA.1.51.1.15. [Cross Ref]
6. van Dooremalen C, et al. Winter survival of individual honey bees and honey bee colonies depends on level of Varroa destructor infestation. PLoS One. 2012;7:e36285. doi: 10.1371/journal.pone.0036285.[PMC free article] [PubMed] [Cross Ref]
7. Neumann P, Carreck NL. Honey bee colony losses. J. Apicult. Res. 2010;49:1–6. doi: 10.3896/IBRA.1.49.1.01. [Cross Ref]
8. Rosenkranz P, Aumeier P, Ziegelmann B. Biology and control of Varroa destructorJ. Invertebr. Pathol. 2010;103:96–119. doi: 10.1016/j.jip.2009.07.016. [PubMed] [Cross Ref]
9. Carreck NL, Ball BV, Martin SJ. Honey bee colony collapse and changes in viral prevalence associated with Varroa destructorJ. Apicult. Res. 2010;49:93–94. doi: 10.3896/IBRA.1.49.1.13. [Cross Ref]
10. Villalobos EM. The mite that jumped, the bee that traveled, the disease that followed. Science. 2016;351:554–556. doi: 10.1126/science.aaf0938. [PubMed] [Cross Ref]
11. Welch A, Drummond F, Tewari S, Averill A, Burand JP. Presence and prevalence of viruses in local and migratory honey bees (Apis mellifera) in Massachusetts. Appl. Environ. Microbiol. 2009;75(24):7862–7865. doi: 10.1128/AEM.01319-09. [PMC free article] [PubMed] [Cross Ref]
12. McMahon DP, et al. Elevated virulence of an emerging viral genotype as a driver of honey bee loss. Proc. R. Soc. B. 2016;283:20160811. doi: 10.1098/rspb.2016.0811. [PMC free article] [PubMed][Cross Ref]
13. Ryabov EV, et al. A virulent strain of deformed wing virus (DWV) of honey bees (Apis mellifera) prevails after Varroa destructor-mediated, or in vitro, transmission. PLoS Pathog. 2014;10:e1004230. doi: 10.1371/journal.ppat.1004230. [PMC free article] [PubMed] [Cross Ref]
14. Loftus JC, Smith ML, Seeley TD. How Honey Bee Colonies Survive in the Wild: Testing the Importance of Small Nests and Frequent Swarming. PLoS One. 2016;11(3):e0150362. doi: 10.1371/journal.pone.0150362. [PMC free article] [PubMed] [Cross Ref]
15. Rosenkranz P. Honey bee (Apis mellifera L.) tolerance to Varroa jacobsoni Oud. in South America. Apidologie. 1999;30(2-3):159–172. doi: 10.1051/apido:19990206. [Cross Ref]
16. Le Conte Y, et al. Honey bee colonies that have survived Varroa destructor. Apidologie. 2007;38(6):566–572. doi: 10.1051/apido:2007040. [Cross Ref]
17. Seeley TD. Honey bees of the Arnot Forest: a population of feral colonies persisting with Varroa destructor in the northeastern United States. Apidologie. 2007;38(1):19–29. doi: 10.1051/apido:2006055.[Cross Ref]
18. Fries I, Imdorf A, Rosenkranz P. Survival of mite-infested (Varroa destructor) honey bee (Apis mellifera) colonies in a Nordic climate. Apidologie. 2006;37:564–570. doi: 10.1051/apido:2006031.[Cross Ref]
19. Locke B. Natural Varroa mite-surviving Apis mellifera honey bee populations. Apidologie. 2016;47:467–482. doi: 10.1007/s13592-015-0412-8. [Cross Ref]
20. Strauss U, Dietemann V, Human H, Crewe RM, Pirk CW. Resistance rather than tolerance explains survival of savannah honeybees (Apis mellifera scutellata) to infestation by the parasitic mite Varroa destructor. Parasitology. 2016;143:374–387. doi: 10.1017/S0031182015001754. [PubMed] [Cross Ref]
21. Danka RG, Harris JW, Dodds GE. Selection of VSH-derived “Pol-line” honey bees and evaluation of their Varroa-resistance characteristics. Apidologie. 2016;47(3):483–490. doi: 10.1007/s13592-015-0413-7.[Cross Ref]
22. Villa JD, Danka RG, Harris JW. Selecting honeybees for worker brood that reduces the reproduction of Varroa destructorApidologie. 2016;47(6):771–778. doi: 10.1007/s13592-016-0433-y. [Cross Ref]
23. Mutinelli F. Veterinary medicinal products to control Varroa destructor in honey bee colonies (Apis mellifera) and related EU legislation—An update. J. Apicult. Res. 2016;55:78–88.
24. Maggi MD, et al. Susceptibility of Varroa destructor (Acari: Varroidae) to synthetic acaricides in Uruguay: Varroa mites’ potential to develop acaricide resistance. Parasitol. Res. 2011;108:815. doi: 10.1007/s00436-010-2122-5. [PubMed] [Cross Ref]
25. Kamler M, Nesvorna M, Stara J, Erban T, Hubert J. Comparison of tau-fluvalinate, acrinathrin, and amitraz effects on susceptible and resistant populations of Varroa destructor in a vial test. Exp. Appl. Acarol. 2016;69(1):1–9. doi: 10.1007/s10493-016-0023-8. [PubMed] [Cross Ref]
26. Genersch E, et al. The German bee monitoring project: a long term study to understand periodically high winter losses of honey bee colonies. Apidologie. 2010;41:332–352. doi: 10.1051/apido/2010014.[Cross Ref]
27. Guzman-Novoa E, et al. Varroa destructor is the main culprit for the death and reduced populations of overwintered honey bee (Apis mellifera) colonies in Ontario, Canada. Apidologie. 2010;71:443–450. doi: 10.1051/apido/2009076. [Cross Ref]
28. vanEngelsdorp, D., Hayes, J., Underwood, R. & Pettis, J. A survey of honey bee colony losses in the U.S., Fall 2007 to Spring 2008. PLoS One3, 4071 (2008). [PMC free article] [PubMed]
29. Traynor KS, et al. Multiyear survey targeting disease incidence in US honey bees. Apidologie. 2016;47:325–347. doi: 10.1007/s13592-016-0431-0. [Cross Ref]
30. Laurent, M., Hendrikx, P., Riebiere-Chabert, M. & Chauzat M. P. A Pan-European epidemiological study on honey bee colony losses 2012–2014, https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/animals/docs/live-animals_bees_bee-report_2012_2014_en.pdf (2016).
31. Lee KV, et al. A national survey of managed honey bee 2013–2014 annual colony losses in the USA. Apidologie. 2015;46:292–305. doi: 10.1007/s13592-015-0356-z. [Cross Ref]
32. Garbian Y, Maori E, Kalev H, Shafir S, Sela I. Bidirectional transfer of RNAi between honey bee and Varroa destructorVarroa gene silencing reduces Varroa population. PLoS Pathog. 2012;8(12):e1003035. doi: 10.1371/journal.ppat.1003035. [PMC free article] [PubMed] [Cross Ref]
33. Aliano NP, Ellis MD. Oxalic acid: A prospective tool for reducing Varroa mite populations in package bees. Exp.Appl. Acarol. 2009;48:303–309. doi: 10.1007/s10493-009-9240-8. [PubMed] [Cross Ref]
34. EPPO: Environmental risk assessment scheme for plant protection products. Chapter 10: Honey bees. EPPO Bulletin40(3), 323–331 (2010)
35. Barbattini, R., Milani, N., Chiesa, F. & d’Agaro, M. Field trials with different acaricides in North-East Italy: Effectiveness against Varroa destructor and tolerance by bees. In: R. Cavallaro (ed) Present Status of Varroatosis in Europe and Progress in the Varroa Mite Control. Proceedings Meet. EC Expert’s Group, Udine, pp. 347–354. Luxembourg: Office Official Pub. European Communities (1989).
36. Wallner K. Varroacides and their residues in bee products. Apidologie. 1999;30:235–248. doi: 10.1051/apido:19990212. [Cross Ref]
37. Medici SK, Castro A, Sarlo EG, Marioli JM, Eguaras M. J. The concentration effect of selected acaricides present in beeswax foundation on the survival of Apis mellifera colonies. J. Apicult. Res. 2012;51(2):164–168. doi: 10.3896/IBRA.1.51.2.03. [Cross Ref]
38. Aral H, Vecchio-Sadus A. Toxicity of lithium to humans and the environment – A literature review. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2008;70:349–356. doi: 10.1016/j.ecoenv.2008.02.026. [PubMed] [Cross Ref]
39. Abele, E. Systemische Wirkung von Lithium-Verbindungen auf die Varroamilbe (Varroa destructor) nach Fütterung von Honigbienen (Apis mellifera) im Käfigversuch. Master Thesis at the Faculty ofAgriculture, University of Hohenheim, Germany (2017).
40. Jia DD, et al. Lithium Chloride alleviates neurodegeneration partly by inhibiting activity of GSK3β in a SCA3 Drosophila model. Cerebellum. 2013;12:892–901. doi: 10.1007/s12311-013-0498-3. [PubMed][Cross Ref]
41. Young AH, Newham JI. Lithium in maintenance therapy for bipolar disorder. J. Psychopharmacol. 2006;20:17–22. doi: 10.1177/1359786806063072. [PubMed] [Cross Ref]
42. Phiel CJ, Klein PS. Molecular targets of lithium action. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2001;41:789–813. doi: 10.1146/annurev.pharmtox.41.1.789. [PubMed] [Cross Ref]
43. Can A, Schulze TG, Gould TD. Molecular actions and clinical pharmacogenetics of lithium therapy. Pharmacol. Biochem. Behav. 2014;123:3–16. doi: 10.1016/j.pbb.2014.02.004. [PMC free article][PubMed] [Cross Ref]
44. Rucker RR, Thurman WN, Burgett M. Honey Bee Pollination Markets and the Internalization of Reciprocal Benefits. Am. J. Agric. Econ. 2012;94(4):956–977. doi: 10.1093/ajae/aas031. [Cross Ref]
45. Williams GR, et al. Standard methods for maintaining adult Apis mellifera in cages under in vitrolaboratory conditions. J. Apicult. Res. 2013;52(1):1–36. doi: 10.3896/IBRA.1.52.1.04. [Cross Ref]
46. Dietemann V, et al. Standard methods for varroa research. J. Apicult. Res. 2013;52(1):1–54.
47. Büchler R, et al. Standard methods for rearing and selection of Apis mellifera queens. J. Apicult. Res. 2013;52(1):1–30. doi: 10.3896/IBRA.1.52.1.07. [Cross Ref]
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