La interacción nociva entre las abejas melíferas (Apis mellifera ) y su parásito intracelular microsporidiano Nosema ceranae se mitigó administrando cepas endógenas o alóctonas de microbiota intestinal

Las abejas melíferas ( Apis mellifera ) enfrentan múltiples factores estresantes que afectan su esperanza de vida, salud y productividad. Entre ellos, Nosema ceranae es un parásito microsporidiano intracelular, que tiene un gran impacto en las colonias de abejas melíferas. Sin embargo, tanto la eficiencia como la inocuidad del tratamiento actual contra N. ceranaeestán siendo cuestionados, lo que plantea la necesidad urgente de desarrollar estrategias profilácticas y curativas alternativas. Se sabe que las comunidades microbianas endógenas (es decir, la microbiota del huésped) juegan un papel importante en la prevención de enfermedades, y más recientemente se observó que tanto las cepas bacterianas como las de levadura emitidas por la microbiota intestinal mejoran la resistencia de los huéspedes contra los parásitos intracelulares tanto en mamíferos como en modelos de insectos. Por lo tanto, el uso de probióticos en la nutrición de las abejas es prometedor para tratar o prevenir enfermedades. Por lo tanto, se necesitan más investigaciones para seleccionar adecuadamente los microorganismos con propiedades probióticas. En una infección experimental in vivo por N. ceranae , el efecto probiótico de dos cepas bacterianas intestinales de abejas ( Parasaccharibacter apium ( PC1sp.) y Bacillus sp. ( PC2 sp.)), Y dos probióticos espectros amplios (Bactocell ® y Levucell SB ® ) se ha medido. Se probaron administraciones tanto curativas como profilácticas: abejas melíferas infectadas con N. ceranae y no infectadas. Para los cuatro candidatos probióticos, se midieron aumentos significativos de las probabilidades de supervivencia (20-30%) después de dos semanas de tratamiento con la administración de 10 3 UFC / ml en jarabe de azúcar, tanto en tratamientos curativos como profilácticos. El presente estudio muestra que las cepas bacterianas endógenas eran al menos tan eficientes y seguras que los probióticos de espectro amplio para aumentar la supervivencia en el contexto de infección experimental con N. ceranae. Por lo tanto, aprovechar las propiedades beneficiosas de la microbiota del huésped es una vía prometedora para desarrollar estrategias curativas eficientes y sostenibles contra enfermedades oportunistas en colonias de abejas melíferas.

Introducción

La abeja melífera europea Apis mellifera es el polinizador más importante presente en los sectores medioambiental y económico agrícola ( Alberoni et al., 2016 ) ( Klein et al., 2017 ). En las últimas décadas, se han reportado muertes importantes en las colonias de abejas melíferas a nivel mundial ( Fairbrother et al., 2014 ; Vanegas, 2017 ). Con la explotación intensiva de las abejas melíferas para la polinización de cultivos agrícolas, la mortalidad de las colonias de abejas se acentúa más en algunas áreas como Europa y EE. UU. Que en otras partes del mundo. Aunque el stock de colonias de miel está aumentando, no satisface nuestras necesidades reales ( Aizen y Harder, 2009 ; Smith et al., 2014) Numerosos estudios coinciden en que las interacciones sinérgicas entre múltiples abióticos ( Doublet et al., 2014 ; Alburaki et al., 2015 ; Kakumanu et al., 2016 ; Poquet et al., 2016 ; Li et al., 2017 ; López et al., 2017 ) y los estresores de los bióticos ( Goulson et al., 2015 ; Dussaubat et al., 2016 ) están involucrados como las principales causas de disminución de las colonias de abejas (véanse también las revisiones de Fairbrother et al., 2014 ; Alberoni et al., 2016 ; Sánchez- Bayo et al., 2016 ; Klein et al., 2017) Las sinergias entre muchos de estos factores tienen un fuerte impacto negativo en la defensa inmune ( Nazzi et al., 2012 ; Di Prisco et al., 2013 ), el metabolismo ( Koch y Schmid-Hempel, 2011 ; Dussaubat et al., 2013 ; Bordier et al., 2017 ), y sobre los mecanismos cognitivos de las abejas ( Klein et al., 2017 ).

Ahora, se sabe que los microorganismos gastrointestinales de las abejas melíferas (es decir, la microbiota intestinal) desempeñan un papel crítico en la regulación de funciones específicas asociadas con el metabolismo y la respuesta inmune ( Evans y López, 2004 ; Alberoni et al., 2016 ; Hyrsl et al., 2017 ) . Los simbiontes microbianos participan en diversos procesos, como la digestión de los alimentos ( Koch y Schmid-Hempel, 2011 ), la desintoxicación de moléculas dañinas, el suministro de nutrientes esenciales, la participación en el sistema de defensa del huésped ( Lemaitre y Hoffmann, 2007 ; Hooper et al., 2012 ) y protección contra patógenos y parásitos ( Evans y López, 2004 ; Flint et al., 2012 ;Engel y Moran, 2013 ; Alberoni et al., 2016 ; Chaplinska et al., 2016 ). Aunque nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes a las interacciones entre la microbiota intestinal y los parásitos aún es parcial, se reconoce ampliamente que la composición de la microbiota intestinal es un factor clave para controlar la dinámica de la infección ( Berrilli et al., 2012 ). A este respecto, los miembros de la microbiota intestinal, incluidos los parásitos, pueden ser beneficiosos, neutrales o perjudiciales para su huésped ( Engel y Moran, 2013 ). Además, según el estado fisiológico del huésped, algunas cepas pueden pasar de oportunistas a infecciosas cuando el huésped está estresado ( Boutin et al., 2013), y potencialmente favorecen las infecciones parasitarias. Nosema ceranae es un parásito microsporidiano intracelular obligado, que es el agente causal de una de las enfermedades más frecuentes de las abejas melíferas, llamada nosemosis ( Higes et al., 2008 ). La infección de la abeja melífera ocurre por la proliferación de esporas de N. ceranae en el intestino medio después de la incorporación de alimentos infectados ( Ptaszynska et al., 2014 ) y la acumulación de esporas a menudo se asocia con mortalidad ( Higes et al., 2007 , 2008 , 2009 ; Martín- Hernández et al., 2007 ).

La enfermedad de Nosemosis está involucrada en perturbaciones fisiológicas y de comportamiento en la colonia de abejas melíferas ( Leoncini et al., 2004 ; Goblirsch et al., 2013 ) como la interrupción de la producción de feromonas, el oleato de etilo (EO). El oleato de etilo (EO) está involucrado en la maduración conductual, en la transición del trabajo de la colmena a las actividades de alimentación ( Leoncini et al., 2004 ; Dussaubat et al., 2010 , 2013 ) y la supresión de la respuesta inmune celular ( Antúnez et al. , 2009 ). La nosemosis también está correlacionada con una modificación del comportamiento natural de alimentación de las abejas melíferas, haciéndolas menos cooperativas para participar en el proceso de trofalaxis ( Naug y Gibbs, 2009 ).La infección por Nosema ceranae afecta principalmente la robustez de las colonias ( Cox-Foster et al., 2007 ; Antúnez et al., 2009 ): las abejas melíferas infectadas son más susceptibles a otros patógenos ( Mayack y Naug, 2009 ).

Además, se sospecha que la acumulación de esporas causa disbiosis en la microbiota intestinal y daña el sistema de defensa del huésped ( Alberoni et al., 2016 ). Dussaubat y col. (2012) mostraron que N. ceranae desencadena la inhibición de la expresión génica involucrada en la regeneración del tejido epitelial intestinal (p. Ej., La vía de señalización de Wnt), que a su vez podría afectar el nicho ecológico de los microbios beneficiosos del huésped. Los daños en el tejido epitelial intestinal son síntomas de enfermedades intestinales, incluida la diarrea. En general, el impacto intracelular de los parásitos protozoarios intestinales puede ser extremadamente dañino, especialmente en individuos que tienen un sistema inmunitario debilitado ( Vitetta et al., 2016) Dado que los agroambientes modernos ejercen un fuerte impacto negativo en la defensa inmune ( Alaux et al., 2010 ; Di Prisco et al., 2013 ), no es sorprendente que la prevalencia de la narizmosis esté aumentando rápidamente ( Higes et al., 2008 ).

El tratamiento actual contra nosemosis homologado en muchos países (por ejemplo EE.UU. y Canadá) es los antibióticos fumagilina-B ® y Fumidil-B ® ( Van Den Heever et al., 2015 ). Desafortunadamente, Nosema spp. Las cepas muestran varios niveles de resistencia a los antibióticos ( Huang et al., 2013 ) y varios estudios han medido la eficacia reducida de Fumagillin-B ® en las infecciones por N. apis y N. ceranae ( Pajuelo et al., 2008 ; Williams et al. , 2011 ). Por esta razón, Fumagillin-B ® fue recientemente prohibido en la Unión Europea ( Gisder y Genersch, 2015) como en Francia en 2002 ( Fernández y Coineau, 2007 ). Además, los antibióticos mostraron alterar el equilibrio de la microbiota del huésped al matar las bacterias endógenas ( Aguilera et al., 2013 ; Li et al., 2017 ). Además, se observó que los antibióticos aumentan la susceptibilidad a la infección por Nosema , lo que induce un impacto negativo en la vida útil de las abejas melíferas ( Li et al., 2017 ).

Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar estrategias alternativas efectivas y sostenibles para mantener o restaurar la homeostasis de la flora intestinal. Alternativamente, los microorganismos beneficiosos (es decir, los probióticos) se utilizaron con éxito como herramientas terapéuticas en la producción animal ( Hamdi et al., 2011 ; Alberoni et al., 2016 ). La administración oral de probióticos ha demostrado un efecto protector sobre la microbiota intestinal del huésped ( Gismondo et al., 1999 ). En los modelos murinos, tanto las cepas probióticas bacterianas como las de levadura también han demostrado su efectividad contra parásitos intracelulares y mostraron una mejora positiva de la salud del huésped ( Alak et al., 1997 , 1999 ; Benyacoub et al., 2005 ;Humen et al., 2005 ; Shukla et al., 2008 ; Dinleyici et al., 2011 ). Con respecto a las abejas melíferas, se ha descubierto que las bacterias intestinales endógenas que pertenecen a las familias Lactobacilliaceae, Bifidobacteriaceae y Acetobacteraceae desempeñan un papel antagónico contra N. ceranae , ya sea en ensayos con abejas enjauladas o en condiciones de campo, al reducir la carga de esporas ( Sabaté et al., 2012 ; Audisio et al., 2015 ; Baffoni et al., 2016 ; Corby-Harris et al., 2016 ).

Nuestro objetivo de investigación se centró en comparar el potencial probiótico de dos cepas endógenas [ Parasaccharibacter apium (PC1 sp.), Bacillus sp. (PC2 sp.)] Y dos probióticos cepas comerciales (Bactocell ® y Levucell SB ® , Lallemand Inc.) como un tratamiento alternativo contra N. ceranae infecciones en las abejas de miel. Estos cuatro candidatos probióticos fueron seleccionados por sus propiedades probióticas probadas o supuestas. Las cepas endógenas [ P. apium (PC1 sp.) Y Bacillus sp. (PC2 sp.)] Están respectivamente estrecha y lejanamente relacionados con cepas que se han utilizado con éxito para inhibir la enfermedad de las abejas melíferas ( Sabaté et al., 2009 ;Yoshiyama y Kimura, 2009 ; Corby-Harris et al., 2016 ) y para mejorar el rendimiento de la colonia ( Sabaté et al., 2012 ). Parasaccharibacter apium (PC1 sp.) Pertenece a la familia Acetobacteraceae , que es particularmente abundante en cultivos de miel, glándulas hipofaríngeas, jalea real y intestino larval a través del comportamiento de alimentación de las abejas obreras ( Corby-Harris et al., 2016 ). En general, las Acetobacteraceae comensales afectan el desarrollo de tejidos en insectos como los mosquitos Anopheles ( Chouaia et al., 2012 ; Mitraka et al., 2013 ) y controlan la maduración de la inmunidad intestinal, como en Drosophila melanogasterRyu et al., 2008 ). Entonces, Bacillus sp. (PC2 sp.) Pertenece al filo Firmicutes y más específicamente al género Bacillus . Las especies de Bacillus son dominantes en el estómago de las abejas melíferas ( Wang et al., 2015 ). Este género puede sobrevivir a altas temperaturas y pH y generalmente es inofensivo, con la excepción de B. anthracis y B. cereus ( Sabaté et al., 2012 ). La administración de cepas de Bacillus ayudó al desarrollo de colonias de abejas al mejorar el rendimiento de la cría y la miel ( Sabaté et al., 2012 ). En cuanto a las cepas comerciales, Bactocell ® (Pediococcus acidilactici ), es una Lactobacillaceae que se utiliza para una amplia gama de especies hospedadoras: cerdos, pollos, camarones y salmónidos ( EFSA, 2012 ). Bactocell ® se demostró para mejorar el rendimiento, por el de las gallinas ( Denev et al., 2013 ), la tasa de supervivencia y el crecimiento de los camarones L. stylirostris ( Castex, 2009 ). Las cepas de Lactobacillacea se usan como formulaciones de probióticos en animales ( Nikoskelainen et al., 2003 ; Bovera et al., 2012 ; Piccolo et al., 2015 ; Billiet et al., 2017 ) y en abejas melíferas ( Evans y Lopez, 2004) Curiosamente, una disminución de Lactobacillaceae sp. se correlacionó con las abejas melíferas poco saludables ( Cox-Foster et al., 2007 ; Olofsson y Vásquez, 2008 ), destacando así el importante papel de esta familia bacteriana en la salud de las abejas melíferas. Levucell ® SB ( Saccharomyces cerevisiae boulardii ) se usa para monogástricos (cerdos y pollos) para mejorar el rendimiento del crecimiento, la histología intestinal ( Le Bon et al., 2010 ), disminuir el transporte de patógenos transmitidos por los alimentos ( Mountzouris et al., 2015 ) y mejorar la inmunidad respuesta ( Collier et al., 2011 ). Además, otros estudios mostraron un impacto positivo de los probióticos comerciales en el hospedador de abejas (Kazimierczak-Baryczko y Szymas, 2006 ; Ptaszynska et al., 2016 ). En consecuencia, decidimos probar el impacto en la salud de las abejas de miel de dos cepas comerciales, Bactocell ® y Levucell ® SB que mostraron efectos beneficiosos en otros animales.

El principal objetivo del presente estudio fue comparar la supervivencia de las abejas enjaulados jóvenes alimentados con dos bacterias intestinales miel de abeja endógena (PC2 y PC1) y dos probióticos comerciales (Bactocell ® , Levucell SB ® , dos marcas comerciales de Lallemand Inc.), experimentalmente infectado por N. ceranae . Este trabajo es uno de los primeros estudios que compara los probióticos comerciales, que generalmente tienen un amplio rango de huéspedes, con cepas endógenas de abejas melíferas, para evaluar si los miembros beneficiosos de la comunidad microbiana intestinal comensal tienen un mejor desempeño tanto en condiciones profilácticas como curativas. La motivación de este estudio es que las estrategias de curación de probióticos se basan en una amplia gama de cepas probióticas comerciales, como las cepas comerciales de bacterias ácidas, como L. rhamnosus.Lactobacillus sp. no pudieron prevenir la nariz y se interrumpió el sistema inmunitario de las abejas melíferas ( Andrearczyk et al., 2014 ; Ptaszynska et al., 2016 ). Además, Andrearczyk et al. (2014) observaron un aumento de Nosema spp. infecciones en abejas jóvenes alimentadas con Lactobacillus sp. comercial . y cepas probióticas de Saccharomyces cerevisiae . Finalmente, se documentaron algunos casos de perturbaciones comerciales de microbiota-huésped inducidas por probióticos ( Doron y Snydman, 2015 ; Durchschein et al., 2016 ). En conjunto, esto sugiere que algunos probióticos de amplio rango no son necesarios para la nutrición de las abejas melíferas (Andrearczyk et al., 2014 ).

El presente estudio muestra que ambas cepas bacterianas endógenas fueron al menos tan eficientes y seguras como los probióticos de espectro amplio para aumentar significativamente la supervivencia en el contexto de infección experimental con N. ceranae .

Materiales y métodos

Aislamiento y cultivo de bacterias intestinales de abejas

Sesenta abejas melíferas adultas sanas fueron recolectadas de cinco colonias diferentes en el Centro de Investigación en Ciencias Animales de Deschambault (CRSAD, Deschambault, Qc, Canadá) y transportadas vivas al Instituto de Biología Integrativa y de Sistemas (IBIS) en la ciudad de Quebec, Canadá . Al llegar, se eliminaron las tripas enteras de abejas del abdomen. Las tripas de las abejas se maceraron, se agitaron en vórtex y se colocaron en un tubo estéril de 10 ml Snap-cap (Sarstedt Inc. No. 62.554.002 PP *) lleno de 5 ml de PBS 1X (solución salina tamponada con fosfato). La comunidad bacteriana intestinal se preparó para el cultivo utilizando varias diluciones (10 −1 a 10 −4) del volumen inicial de PBS 1X. Luego, 100 μL de estas diferentes diluciones se transfirieron a placas de Petri de agar Tryptic Soy Broth (TSB) (Difco Inc.) y en agar De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) (Difco Inc.), ambos incubados a 37 ° C durante 48 h en condiciones aeróbicas. Después de 48 h, se recogieron colonias individuales y se transfirieron a nuevas placas de agar para obtener cepas puras. Cada cepa se transfirió en un criotubo de 2 ml para almacenamiento a largo plazo mediante la adición de glicerol estéril a una concentración final del 15%; Las muestras congeladas se almacenaron a -80 ° C para una mayor caracterización molecular y cultivo.

Extracción de ADN y amplificación por PCR del gen de ARNr 16S de cepas probióticas endógenas

Para la extracción de ADN, se tomaron muestras de cepas aisladas de sus medios específicos. Luego, se extrajo el ADN usando el kit Dneasy Blood and Tissues (Qiagen Inc., 2016 ) como se indica en el protocolo del fabricante con las siguientes modificaciones: las cepas cultivadas se suspendieron en 200 μL de PBS 1X seguido de un choque térmico a 95 ° C durante 5 minutos. Los siguientes pasos del protocolo se completaron como se indica en el protocolo del fabricante (Pretratamiento para bacterias grampositivas en DNeasy ®Manual de sangre y tejidos. 2006). Para la amplificación por PCR, el gen 16S rRNA se apuntó usando los cebadores bacterianos universales (Sigma-Aldrich, Genosys) F-Tot (5′-GCAGGCCTAACACATGCAAGTC) y 1389R (5′-AGGCCCGGGAACGTATTCAC). La PCR se realizó en un volumen total de 50 μL: H2O 18 μL; TaKaRa Taq 25 μL, F-tot (10 μM) 25 μL; 1389R (10 μM) 25 μL; ADN 2 μL. Después de la desnaturalización inicial a 95 ° C durante 2 min, la amplificación se realizó utilizando 30 ciclos de 1 min a 95 ° C, 1 min a 55 ° C y 1 min 30 a 72 ° C seguido de una extensión final a 72 ° C durante 5 min. Luego, los productos de amplificación se procesaron en geles de agarosa al 2.0% y se enviaron a la «Forma de placa de análisis genéticos» de la Universidad de Laval para una secuenciación de ADN Sanger. La identificación taxonómica de las secuencias del gen 16S rRNA se completó utilizando la herramienta de análisis de secuencias BLAST de las bases de datos NCBI.

Supervivencia de cepas probióticas endógenas y comerciales en jarabe de azúcar

Las cepas bacterianas endógenas utilizadas en esta investigación se obtuvieron del stock de glicerol (almacenamiento a -80 ° C) y se extendieron sobre placas de agar Tryptic Soy Broth (TSB) o De Man-Rogosa-Sharpe (MRS). Las placas se incubaron a 37 ° C durante 48 h en condiciones aeróbicas. Después de 48 h, se inocularon 5–6 unidades formadoras de colonias (UFC) en 10 ml de jarabe de azúcar (1: 1, w: v). Paralelamente, los probióticos comerciales también se inocularon en 10 ml de jarabe de azúcar (1: 1, w: v). Posteriormente, 1 ml de cultivos de cada solución (jarabe de azúcar + UFC) se sembraron en placas en medio de agar MRS y TSA, dependiendo de la cepa bacteriana, a T = 0, 48 h, 72 h, y 1, 2, 3 semanas por triplicado. Todas las placas se incubaron a 37 ° C durante 48 h en condiciones aeróbicas.

Jaulas de abejas melíferas, condiciones experimentales y Nosema spp. Infección

Los experimentos se realizaron en el Centro de Investigación en Ciencias Animales de Deschambault (CRSAD, Deschambault, 46 ° 40′26.85 ″ N, 71 ° 54′54.39 ″ W), Québec, Canadá. El efecto de los probióticos endógenos y comerciales contra Nosema spp. La infección se investigó in vivo en abejas adultas, mantenidas en jaulas en condiciones de laboratorio. Todas las abejas utilizadas en este estudio se originaron en cuatro colonias europeas de abejas melíferas ( A. mellifera L.) encabezadas por reinas hermanas en septiembre de 2015. De acuerdo con la metodología descrita por Williams et al. (2013), cinco peines de cría tapada con ojos oscuros y pupas de piel gris fueron transferidos a una «colonia de guardería» que consistía en un cuerpo de colmena Langstroth con un marco de miel y polen para el suministro de alimentos. Para obtener nuevas abejas emergentes, la colonia de vivero se colocó en una incubadora (modelo 3040, Forma Scientific Inc., Ohio, EE. UU.) Ajustada a 35 ° C y 55% de humedad relativa durante 6 días. Las abejas jóvenes de 4 a 6 días de edad fueron colocadas en un cuerpo de colmena de 4 cuadros antes de ser distribuidas aleatoriamente en jaulas. Cada jaula consistía en 14 oz. vaso ventilado de plástico de un solo uso ( Evans et al., 2009) y una jeringa estéril invertida (20 ml, BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.) que contiene jarabe de sacarosa. Las abejas rápidamente aprendieron a tomar el jarabe de la abertura inferior de la jeringa. Veinte abejas se distribuyeron al azar en cada jaula y todas las jaulas se mantuvieron en una habitación ambientalmente controlada (30 ° C ± 1 ° C y 50% ± 5% de humedad relativa) en oscuridad total durante la duración del experimento (27 días). Las jaulas se distribuyeron aleatoriamente en cada grupo experimental (Tabla 1 ) y los tratamientos comenzaron en el día 0. Cada grupo experimental estaba compuesto por 20 jaulas. Se muestrearon cinco jaulas por grupo experimental cada vez. Hay cuatro grupos de tratamiento, uno por cepa probiótica: Bactocell ® , Levucell SB ®, PC1 y PC2. Para cada grupo de tratamiento hay dos condiciones, curativa versus administración profiláctica, y dos controles: con y sin Nosema , por lo tanto totalizando 10 grupos experimentales.TABLA 1

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Tabla 1 . Grupos experimentales (20 abejas en cada jaula para un total de 400 abejas en cada grupo experimental).

Para inducir Nosemosis, se obtuvieron esporas de N. ceranae directamente antes de los experimentos de ventrículo de abejas melíferas infectadas naturalmente como se describe por Fries et al. (2013) . Para asegurar una infección experimental homogénea de Nosema en todo el grupo experimental, se verificó la concentración de esporas de Nosema en jarabe de azúcar tres veces antes de la administración. Para garantizar que todas las abejas tuvieran un bajo nivel de infección por Nosema , utilizamos abejas recién emergidas (de 4 a 6 días de edad) de colonias sanas, que fueron verificadas por PCR para determinar la prevalencia de Nosema . Un micro litro de jarabe de sacarosa (1: 1, w: v) que contiene 1 000 000 de Nosema ssp. las esporas se administraron por vía oral a Nosemajaulas grupales en el día 0, con la jeringa invertida. Después de la administración de esporas, los probióticos endógenos o comerciales se alimentaron de acuerdo con el protocolo con una dosis de 10 3 UFC por ml. Probióticos comerciales Bactocell ® y Levucell ® fueron suministrados por Lallemand Inc. ( Lallemand, 2016 , Montreal, Quebec, Canadá), mientras que los candidatos probióticos endógenos fueron aisladas de las tripas de adultos de abejas sanas (como se describe en la sección anterior). Cada cepa probiótica se mezcló completamente en jarabe de sacarosa (1: 1, w: v). La solución de sacarosa se reponía semanalmente con una solución recién hecha en todas las jaulas. Cada 2 días, se registró el número de abejas muertas en cada jaula para evaluar la tasa de mortalidad en cada grupo. El día 0, se tomaron muestras de 50 abejas para evaluarInfección por N. ceranae . Luego, una vez por semana hasta el día 27, se muestrearon al azar cinco jaulas por grupo, y las muestras de abejas se almacenaron a -80 ° C para análisis genómicos adicionales y evaluación de la presencia de N. ceranae en el intestino de las abejas melíferas.

Detección Molecular de Nosema

El ADN total para cada muestra (un grupo de 5 abejas por jaula, 5 jaulas por grupo experimental) se extrajo de la abeja intestinal utilizando una extracción rápida de sal como se describe en ( Aljanabi y Martínez, 1997) con algunas modificaciones. Los tejidos intestinales se extrajeron de las abejas almacenadas a -80 ° C y se colocaron en un microtubo de 1,5 ml. Agregamos 440 μL de tampón de homogeneización de sal estéril (NaCl 0.4 M Tris-HCl 10 mM pH 8.0 y EDTA 2 mM pH 8.0), 40 μL de SDS al 20% y 8 μL de proteinasa K de 20 mg / mL (400 μg / mL final concentración) en el microtubo de 1,5 ml y se agitó vorticialmente durante unos segundos. A continuación, las muestras se incubaron a 60 ° C durante al menos 1 hy se agitaron en vórtex cada 20 min. Luego, se añadieron 300 μL de NaCl 6 M a cada muestra seguido de una centrifugación durante 20 minutos a 13.300 rpm a 4 ° C. El sobrenadante se transfirió a un nuevo microtubo de 1,5 ml. Después de este paso, se añadieron 600 μL de isopropanol frío y se incubaron a -20 ° C durante 30 min. La centrifugación se repitió antes de recoger el sobrenadante. Este paso se repitió dos veces y el sedimento se secó durante la noche. El sedimento seco se suspendió en 100 μl de agua estéril y se almacenó a 4 ° C. Luego,N. ceranae se detectó por amplificación por PCR. La narizEl marcador genético se apuntó usando los cebadores (Sigma-Aldrich, Genosys), L203 (5′-CAGTTATGGGAAGTAATATTATATTG) y R253 (5′-TTGATTTGCCCTCCAATTAATCAC). La PCR se realizó en un volumen total de 50 μL: BSA no acetilada (1 mg / mL) (20 μL; dNTPs (2.5 mM) (4 μL); Cebador directo, L203 (3 μM) 2.5 μL; Cebador inverso, R253 (3 μM) 2.5 μL; MgCl2 (25 mM) (2.5 μL); tampón de reacción (10X) (Feldan); Taq (Feldan (10 U / μL) 25 μL, H2O 12.2 μL y ADN 1 μL. Después de la desnaturalización inicial. a 94 ° C durante 2 minutos, la amplificación se realizó usando 29 ciclos de 45 segundos a 94 ° C, 45 segundos a 56 ° C y 45 segundos a 72 ° C seguido de una extensión final a 72 ° C durante 5 minutos. Luego, los productos de amplificación se corrieron en geles de agarosa al 2,0% para la detección de fragmentos de ADN específicos de 250 pb, junto con una escalera de ADN de 100 pb.

Detección Molecular de Candidatos Probióticos Endógenos

Parasaccharibacter apium sp. (PC1) Detección

El ARN total para cada muestra (una piscina de 5 abejas por jaula, 5 jaulas por grupo experimental) se extrajo de abeja intestinal usando TRIzol ® protocolo reactivo de Invitrogen ( Chomczynski, 1993 ) como se describe en Boutin et al. (2015) . El ADN complementario (ADNc) se sintetizó usando qScript ™ cDNA SuperMix (Quanta Biosciences). Se mezcló un ARN total de 0,5 μg con 4 μL de cDNA SuperMix de qScript ™ y un volumen variable de agua libre de nucleasas para obtener 20 μL como volumen total, siguiendo las instrucciones del fabricante (Quanta BioSciences, Inc. 2013). Luego, se realizó una PCR estándar en Sigma (Biometra ®El termociclador T1 plus, Montreal Biotech Inc.) PCR se llevó a cabo en un volumen total de 12.5 μL: TaKaRa 6.25 μL; Primer M3_325_Fw (5′-GAAGCCGGCATCGTGGCCTG) (Sigma-Aldrich, Ciencias de la vida) 1,25 μL; Primer M3_325_Rv (5′-ATGTACACGGCATCTGTCCA) (Sigma-Aldrich, Ciencias de la vida)) 1,25 μL; Plantilla de ADNc 1.875 μL y H2O 1.875 μL. Después de la desnaturalización inicial a 94 ° C durante 1 minuto, la amplificación se realizó utilizando 41 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 60 ° C y 45 segundos a 72 ° C seguido de una extensión final a 72 ° C durante 10 minutos .

Bacillus sp. (PC2) Detección

La detección se realizó en ADN genómico, utilizando el protocolo de extracción como se describe en Aljanabi y Martínez (1997) seguido de dos purificaciones de ADN sucesivas y una PCR estándar realizada en Sigma (Biometra ®El termociclador T1 plus, Montreal Biotech Inc.) PCR se llevó a cabo en un volumen total de 12.5 μL: TaKaRa 6.25 μL; Primer B3_339_Fw (5′-AAAAACTCGGTGGCGTAATG) (Sigma-Aldrich, Ciencias de la vida) 1,25 μL; Primer B3_339_Rv (5′-TCAACACCTTTTAAGGGTGC) (Sigma-Aldrich, Ciencias de la vida)) 1.25 μL; Plantilla de ADN 1.875 μL y H2O 1.875 μL. Después de la desnaturalización inicial a 94 ° C durante 1 min, la amplificación se realizó utilizando 26 ciclos de 30 s a 94 ° C, 30 s a 60 ° C y 45 s a 72 ° C, seguido de una extensión final a 72 ° C durante 10 min. . Luego, los productos de amplificación se ejecutaron en geles de agarosa al 2.0% para ambos probióticos endógenos.

Cuantificación de las cargas de esporas de Nosema ceranae en Honeybee Gut

Para cada grupo experimental, se tomaron muestras aleatorias de cinco abejas de una jaula y se agruparon para detectar la presencia de N. ceranae utilizando un protocolo adaptado derivado de Fries et al. (2013). En resumen, procedemos de la siguiente manera: todos los materiales se limpiaron con etanol al 70%. Los cinco abdómenes disecados se molieron en 5 ml de agua destilada dentro de un mortero usando una mano de mortero. Luego, se eliminaron los desechos grandes y el contenido de mortero se vertió en un tubo plano de 10 ml y se almacenó durante la noche a 4 ° C. A continuación, se realizó el recuento de esporas utilizando una cuadrícula de hemocitómetro. Las rejillas del hemocitómetro se esterilizaron con etanol al 70% y un KimWipes ™, luego la preparación se homogeneizó manualmente mediante agitación vorticial. Posteriormente, se colocó un cubreobjetos de vidrio sobre la rejilla del hemocitómetro. Luego, se colocaron 20 μL de cada muestra agrupada en el hemocitómetro. El hemocitómetro se colocó en un microscopio óptico equipado con una lente de aumento de 400x para observación. Todos los análisis se realizaron el día 14 (edad de las abejas = 18-20 días) de la experiencia. Para que las cargas de esporas cuenten, Se analizaron grupos de 5 abejas por jaula. El conteo de esporas se realizó por duplicado para reducir la variabilidad (Figura1 ) La estimación del número de esporas por intestino de abeja se calculó con la siguiente fórmula: [(Recuento de esporas sin procesar de 5 bloques) * 50.000)] = número de esporas por abeja.FIGURA 1

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Figura 1 . Estimación del número de esporas por abeja en cada grupo experimental: se tomaron imágenes de un hematocitómetro colocado en un microscopio óptico equipado con una lente de aumento de 400x para observación. Cinco abejas por grupo experimental fueron molidas juntas. Para el conteo de esporas, utilizamos 5 bloques (cuatro bloques localizados en la esquina de la cuadrícula y el que está en el centro de la cuadrícula de 5 × 5). Cada bloque representa 4 × 4 cuadrículas (16 cuadrados). Las imágenes ilustradas en esta figura representan una de las cuadrículas más pequeñas de 4 × 4 (16 cuadrados) de las cuadrículas de 5 × 5 que se utilizan para el conteo de esporas.

Análisis estadístico

El análisis de supervivencia del experimento in vivo se realizó con el Método Kaplan-Meier utilizando lenguaje R ( R Development Core Team, 2008 ). El análisis de Kaplan-Meier ilustra las probabilidades de supervivencia de las abejas entre grupos durante el experimento de 27 días teniendo en cuenta los datos censurados que representan el muestreo de jaulas durante el experimento in vivo . La mortalidad de datos registrada para cada jaula fue formateada usando el script de nuestro grupo y los individuos de supervivencia fueron analizados usando el paquete «Survival» R. Las curvas de supervivencia de múltiples grupos se obtuvieron con el Kaplan-Meier ( Kaplan y Meier, 1958) fórmula (modelo Cox ajustado). La estimación de Kaplan-Meier generalmente supone independencia entre los eventos de muerte individuales. Para determinar con el tiempo y durante un tiempo específico si existe una diferencia estadísticamente significativa entre el control (grupo no infectado) frente al grupo experimental (grupos curativos y profilácticos) y dentro de los grupos experimentales, realizamos una regresión de riesgos proporcionales de Cox usando la función coxph en R. La función de riesgo o tasa de mortalidad es la probabilidad instantánea de muerte para las personas que aún están vivas. El modelo de regresión de Cox estima la razón de riesgo de morir al comparar el tratamiento versus el control (grupo no infectado). Los valores P del resumen del modelo de Cox indican la importancia de las diferencias entre los grupos comparados (Paquete de supervivencia, R).

La prevalencia de Nosema se evaluó cuantificando el número de esporas de N. ceranae por abeja y por taza de forma independiente para cada grupo experimental en el día 14. La importancia de las diferencias entre nuestros datos recopilados se evaluó mediante el uso de una prueba de varianza (prueba ANOVA) en R (Tablas 2 , 3 ).TABLA 2

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Tabla 2 . Spore cuenta estadísticas sobre grupos infectados con Nosema ceranae .TABLA 3

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Tabla 3 . ANOVA en conteos de esporas en grupos infectados con Nosema ceranae .

Se realizó un análisis de varianza de un solo factor (ANOVA) para evaluar si se produjeron diferencias significativas en términos de diferencia de supervivencia entre el uso profiláctico (es decir, probiótico versus control) y curativo (es decir, Nosema + probiótico versus control de Nosema ) de los cuatro probióticos cepas (Tabla 7 ).

Resultados

Supervivencia de probióticos endógenos y comerciales en jarabe de azúcar

Demostramos que la cantidad de UFC tanto para los probióticos endógenos como para los comerciales era estable después de 3 semanas en el jarabe de azúcar (1: 1) (azúcar: agua), confirmando así que la formulación del jarabe era adecuada para la administración de los cuatro probióticos . Después de 3 semanas, se registró una disminución de diez veces en los recuentos de UFC para las cuatro cepas candidatas a probióticos. Para ser conservador, la formulación de jarabe (1: 1) (azúcar de jarabe + UFC) utilizada en este estudio se renovó semanalmente.

Títulos de esporas de Nosema ceranae en los grupos experimentales

Nosema ceranae se identificó inequívocamente con la amplificación de un marcador taxonómico (ver métodos). En T0 (antes de la infección por Nosema ), la PCR diagnóstica fue negativa. Las esporas de N. ceranae no se registraron ni en el control (grupo no infectado) (grupo 1) ni en los controles probióticos (grupo 3, 5 y 9) en el día 14. Sin embargo, se observó una presencia mínima de esporas en el candidato probiótico Bacillus (grupo 7). Luego, se registraron fuertes ocurrencias de esporas de N. ceranae en todos los grupos infectados (2, 4, 6, 8 y 10; ver Tablas 2 , 3 ; Figura 2 ).FIGURA 2

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La Figura 2 . Recuentos de esporas por abeja en los grupos experimentales infectados con Nosema ceranae . Se analizaron quince abejas muestreadas el día 14 (5 abejas por grupo experimental, una jaula por grupo experimental).

Honey Bee Survival

Durante este experimento de 27 días, se registraron las muertes acumuladas cada 2 días y se estimaron las probabilidades de supervivencia para cada grupo mediante la comparación de las curvas de Kaplan-Meier obtenidas e ilustradas en la Figura 3 .FIGURA 3

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Figura 3 . Kaplan-Meier Survival curvas de distribución de las abejas en cada grupo experimental durante el experimento de la abeja en jaula de 27 días. El eje y representa las estimaciones de Kaplan-Meier de las probabilidades de supervivencia. El eje x representa los días experimentales. (A) Efecto de Bactocell ® administración (profiláctico: Bactocell ® grupo y curativa: Nosema + Bactocell) sobre la supervivencia de abeja. (B) Efecto de la administración de Levucell ® (profiláctico: grupo Levucell y curativo: Nosema + Levucell) sobre la supervivencia de las abejas melíferas. (C) Efecto de PC1 sp. ( Parasaccharibacter apiumadministración de candidatos a probióticos) (profiláctico: PC1 sp. group y curativo: Nosema + PC1 sp.) sobre la supervivencia de las abejas melíferas (D) Efecto de PC2 sp . ( Bacillus probiótico candidato) administración (profiláctico: PC2 grupo sp y curativa:. Nosema + PC2 sp.) Sobre la supervivencia de abeja.

Efecto de la infección por Nosema ceranae sobre la supervivencia de las abejas melíferas

Se encontraron diferencias significativas de las probabilidades de supervivencia entre todos los grupos desde la segunda semana del experimento (día 8 al día 14) hasta el último día (día 27). La Tabla 4 muestra las comparaciones del modelo de Cox de las probabilidades de supervivencia entre el grupo de control (grupo no infectado) y todos los demás grupos. El día 25, todos los grupos que recibieron candidatos a probióticos exhibieron tasas de supervivencia significativamente más altas en comparación con el grupo control (grupo no infectado; Tabla 4 ). Las comparaciones del modelo de riesgo proporcional de Cox mostraron que las abejas melíferas infectadas con N. ceranae tenían una probabilidad de supervivencia significativamente menor que las abejas del grupo control (grupo no infectado) el día 18 (13.5% menos), 25 (10.6% menos) y 27 (9,5% menos), evidenciando el efecto negativo de N. ceranae infección en la supervivencia de las abejas melíferas.CUADRO 4

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Tabla 4 . Comparaciones del modelo de riesgo proporcional de Cox (modelo Cox) entre la supervivencia del grupo control (ctrl) y el grupo Nosema y los grupos experimentales con administración curativa de probióticos probados durante el experimento de 27 días.

La administración profiláctica de probióticos Comercial (Bactocell ® y Levucell SB ® )

En general, las abejas de miel que reciben una administración profiláctica de Bactocell ® y Levucell SB ® tenían una probabilidad de supervivencia significativamente mayor que el grupo no infectado control (Cox-modelo, las Figuras 3A, B ). Desde el día 14 al día 27, las probabilidades de supervivencia de las abejas que recibieron una dosis profiláctica de la comercial probiótico Bactocell ® fueron significativamente más altos que los de las abejas grupo control que recibió jarabe de sacarosa. En el día 18, las abejas tienen una probabilidad significativa de supervivencia más alta (curvas de Kaplan-Meier, + 30%) que las abejas a partir del grupo control (54,2% ± 2,49 y 83,0% ± 1,89, respectivamente para el control y Bactocell ® grupo). Del mismo modo, las abejas alimentadas con el probiótico comercial Levucell SB ®también mostró una probabilidad de supervivencia significativamente mayor en comparación con el grupo de control en los días 8, 14 y del día 20 al 27 (Figura 3B , Tabla 5 ). El día 22, la probabilidad de supervivencia de las abejas que recibieron una dosis profiláctica del probiótico comercial Levucell SB ® fue del 75,4% ± 2,15 en comparación con el 45,5% ± 2,49), que es un aumento significativo del 29,9% de la tasa de supervivencia.CUADRO 5

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Tabla 5 . Comparaciones del modelo de riesgo proporcional de Cox (modelo Cox) entre la supervivencia del grupo de control (ctrl) y los grupos de control probiótico durante el experimento de 27 días.

Administración profiláctica de probióticos endógenos.

En general, las abejas melíferas que recibieron una administración profiláctica de probióticos endógenos PC1 y PC2 tuvieron una probabilidad de supervivencia significativamente mayor que las abejas del grupo de control no infectado, desde la tercera semana del experimento (Tabla 5) hasta el último día (día 27). El día 22, las abejas que recibieron una dosis profiláctica de PC1 tuvieron un aumento significativo de la supervivencia (modelo Cox, + 30%), en comparación con la supervivencia del grupo control (75.5% ± 2.09 en comparación con 45.5% ± 2.49). La administración profiláctica del candidato PC2 también se correlacionó con probabilidades de supervivencia significativamente mayores en el día 14 y 20 a 27 en comparación con el grupo de control. La mayor diferencia de supervivencia se registró en el día 20: el 83.0% ± 1.88 de las abejas que recibieron una dosis profiláctica del candidato PC2 sobrevivieron, mientras que el 50.5% ± 2.5 de las abejas del grupo de control no infectado sobrevivieron.

Administración curativa de probióticos comerciales

Abejas que reciben una administración curativo de Bactocell ® después ceranae N. infección (grupo de prueba 4) mostraron tasas de supervivencia significativamente mayor que el grupo control (grupo no infectado) y Nosema infectadas abejas del grupo de control desde el día 14 hasta el final de la in vivo experimento ( Tablas 4 , 6 , Figura 3A ). En el día 22, las curvas de Kaplan-Meier indican una tasa de supervivencia de 34,2% ± 2,37 para Nosema grupo control y 60,5% ± 2,43 para el Nosema + Bactocell ® grupo de prueba (es decir, grupo que recibió una dosis curativa de Bactocell ® ), lo que representa una supervivencia aumento del 26,3%. IdénticamenteEl grupo de prueba Nosema + Levucell SB ® mostró tasas de supervivencia significativamente más altas que en el grupo de control Nosema . El día 14, las tasas de supervivencia fueron del 71.0% ± 2.27 para el grupo de control Nosema y del 87.0% ± 1.68 para el grupo de prueba Nosema + Levucell SB ® , lo que representa un aumento de la supervivencia del 16%. El día 22, las abejas del grupo de prueba Nosema + Levucell SB ® tuvieron una tasa de supervivencia del 75.4% ± 2.15 en comparación con el 34.2% ± 2.37 para el grupo infectado con Nosema , que es 41.2% más alto.CUADRO 6

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Tabla 6 . Comparaciones del modelo de riesgo proporcional de Cox (modelo Cox) entre la supervivencia de los grupos de infección artificial de Nosema ( Nosema ctrl) y los grupos experimentales con administración curativa de probióticos probados durante el experimento de 27 días.

Administración curativa de probióticos endógenos

Las probabilidades de supervivencia de las abejas que reciben una administración curativa del probiótico endógeno PC1 después de una infección artificial de N. ceranae ( grupo de prueba Nosema + PC1, grupo 6) mostraron probabilidades de supervivencia significativamente más altas en comparación con las abejas del grupo control Nosema (grupo 2) desde el día 14 al día 27 (Tabla 6 , Figura 3D ). Las tasas de supervivencia fueron significativamente más altas en el grupo 6 en comparación con el grupo 2 desde el día 14 hasta el final del experimento (32.7% ± 2.35 y 53.5% ± 2.49). Finalmente, las abejas infectadas que reciben el probiótico endógeno PC2 ( grupo de prueba Nosema + PC2, grupo 8) mostraron un aumento significativo de la supervivencia del día 14 al día 27 (Tabla 6, Figura 3C ), en comparación con el grupo de control Nosema . En el día 27, se observó un aumento significativo de la supervivencia del 19,9% (52,6% ± 2,57% frente a 32,7% ± 2,35) para el grupo de prueba Nosema + PC2.

Diferencial de supervivencia entre grupos curativos y grupos profilácticos

Se detectaron diferencias significativas con respecto al diferencial de supervivencia entre los grupos profilácticos (es decir, probiótico versus control) y los grupos curativos (es decir, Nosema + probiótico versus . Control de Nosema ) a partir del día 15 en adelante. El diferencial de supervivencia entre los grupos curativos y profilácticos fue significativo para Levucell SB ® en T15, T18, T20, T22, T25. Para PC2, la diferencia de supervivencia entre los grupos curativos y profilácticos fue significativa en T15, T18, T25. Por último, para Bactocell ® , diferencial de supervivencia entre los grupos curativos y profilácticos sólo fue significativa en T25.

Discusión

Los resultados mostraron claramente que tanto la administración profiláctica como la curativa de los cuatro candidatos a probióticos, ya sea con un amplio rango de huéspedes y endógenos, aumentaron significativamente las tasas de supervivencia de las abejas melíferas del 20 al 40% en comparación con el grupo de control no infectado. Para una administración profiláctica, mayores tasas de supervivencia se obtuvieron por (en orden decreciente): PC1, Bactocell ® , Levucell SB ® , y PC2. Para la administración curativa, mayores tasas de supervivencia se obtuvieron para (en orden decreciente): Levucell SB ® , PC1, PC2 y Bactocell ® . Sin embargo, no hubo diferencias significativas en términos de mejora de la supervivencia entre candidatos probióticos comerciales y endógenos.

Con respecto a los patrones de tasas de supervivencia, se observó una disminución drástica en el día 14 tanto en el control como en el control de Nosema . Desde el día 14 hasta el final del ensayo (día 27), la supervivencia del grupo de control de Nosema siempre fue menor que el control sin Nosema , lo que confirma que la infección por Nosema ejerció un efecto negativo sobre la supervivencia. Además, esta disminución drástica no ocurrió en los grupos alimentados con probióticos, con o sin infección por Nosema . Este resultado sugiere fuertemente que los probióticos fueron muy eficientes para mejorar la supervivencia de las abejas tanto en el modo de acción curativo como profiláctico. Con respecto a la causa misma de esta disminución drástica de supervivencia en el día 14 tanto en el control como en Nosemacontrol, observamos un patrón similar de disminución repentina de la supervivencia en un ensayo preliminar (datos no mostrados), aunque en menor medida. Presumiríamos que mantener las abejas en jaulas alimentadas sin ingesta de proteínas (es decir, jarabe de azúcar puro 1: 1) desencadenó la disbiosis por microbiota y, a su vez, inflamación intestinal. En los grupos alimentados con probióticos, es muy probable que ambos efectos anti-microbianos y estimulaciones de respuesta inmune positiva, que se demostró tanto para Bactocell ® y Levucell SB ® , en organismos huéspedes alternativos ( Qamar y otros, 2001. ; Standen et al. 2013), mitigó la disbiosis intestinal, aumentando así la tasa de supervivencia. Luego, a partir del día 15 en adelante, observamos diferencias significativas con respecto al diferencial de supervivencia entre los grupos curativos (es decir, Nosema + probiótico versus control de Nosema) y los grupos profilácticos (es decir, probiótico versus control; Tabla 7 ). Básicamente, la diferencia de supervivencia entre los grupos curativos y profilácticos varía de un grupo experimental a otro, y de un tiempo de muestreo a otro. Este resultado sugiere que, bajo uso curativo, al menos tres de las cuatro cepas probióticas analizadas tuvieron un efecto no aditivo sobre la supervivencia en relación con el uso profiláctico. Por lo tanto, aunque puede sugerir que estas tres cepas probióticas ejercen un efecto específico sobre Nosema actividad, se necesitan más experimentos para evaluar unívocamente si existe una interacción funcional directa con el parásito.CUADRO 7

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Tabla 7 . El análisis de varianza de un solo factor de ANOVA se realizó para evaluar si ocurrieron diferencias significativas en términos de supervivencia entre la administración profiláctica y curativa de probióticos ( valores p significativos <0.05).

Finalmente, a pesar del aumento significativo de la tasa de supervivencia en los grupos curativos, no se observó una reducción significativa de las esporas de Nosema en ninguno de los cuatro grupos de probióticos. A primera vista, este resultado puede ser sorprendente ya que se registraron disminuciones significativas de las cargas de esporas de N. ceranae en estudios previos: Baffoni et al. (2016) combinaron varias cepas de microorganismos aislados del intestino de las abejas melíferas y descubrieron que tanto las cepas de Bifidobacteriaceae como Lactobacilliaceae estaban correlacionadas con una disminución significativa de las cargas de esporas de N. ceranae . Maggi y col. (2013) también informaron una reducción del 52% de N. ceranaeesporas por abeja luego de la aplicación de la bacteria L. Johnsonii metabolitos en abejas enjauladas. Finalmente, Corby-Harris et al. (2016) documentaron una reducción significativa de las esporas de Nosema luego de la administración de la cepa endógena P. apium . Sin embargo, dos parámetros clave de estos estudios anteriores son diferentes de los del presente trabajo y podrían explicar, al menos en parte, los resultados contrastados en términos de reducción de esporas. Primero, se administraron títulos relativamente bajos (que van desde 1.10 3 a 1.10 4 esporas por microlitro de jarabe de azúcar) de esporas de N. ceranae a las abejas melíferas enjauladas para inducir la nariz ( Maggi et al., 2013 ;Baffoni et al., 2016 ; Corby-Harris et al., 2016 ). Aquí, el título administrado de esporas de N. ceranae fue de 100 a 1,000 veces mayor (1.10 6 esporas por microlitro de jarabe de azúcar). En segundo lugar, los títulos de probióticos administrados en el presente estudio fueron de 100 a 1,000 veces más bajos que los estudios previos ( Baffoni et al., 2016 ; Corby-Harris et al., 2016 ). Curiosamente, Corby-Harris et al. (2016) administraron una cepa estrechamente relacionada del simbionte endógeno P. apium a 2.10 6 UFC por ml, que es dos mil veces mayor que la administrada en el presente trabajo. A pesar de esto, N. ceranaelos títulos se mantuvieron lo suficientemente altos como para que la reducción estadísticamente significativa de las esporas registrada en esos estudios previos no fuera biológicamente relevante ( Alberoni et al., 2016 ) para reflejar claramente un efecto antagonista sobre la nariz, ya que la reducción de la carga de esporas no excedió el 40%, cuando en comparación con el grupo de control infectado. De hecho, los trabajadores de colonias infectadas exhibieron recuentos medios de nosema que van desde 0.04 a 1.87.10 6 esporas por abeja ( Traver y Fell, 2011 ). En el ensayo de abejas enjauladas de Corby-Harris et al. (2016) , sin embargo, el grupo alimentado con probióticos albergaba una media de 951.10 6 esporas por abeja. Además, no se registraron mejoras en la supervivencia en todos los grupos experimentales ( Corby-Harris et al., 2016) Esto no es sorprendente al considerar nuestros resultados ya que se observaron diferencias significativas en la supervivencia después de 14 días, mientras que la duración del desafío con las esporas de Nosema en Corby-Harris et al. (2016) fue de 10 días. Se observó previamente un pico de mortalidad de abejas en el día 14 después de la infección ( Dussaubat et al., 2012 ) corroborando así nuestros resultados con respecto a la dinámica de infección por N. ceranae .

Más importante aún, el protocolo de administración de aditivos alimentarios probióticos utilizado por Corby-Harris et al. (2016) fue bastante diferente del presente estudio. Corby-Harris y col. (2016) administraron la cepa probiótica de P. apium (2.10 6 UFC) durante 7 semanas en la empanada de polen en la hibernación de colonias y, por lo tanto, antes del ensayo de abejas en jaula. En nuestro experimento, las cepas de probióticos (1.10 3 UFC por ml) se administraron a través de jarabe de azúcar durante el ensayo en jaula. Luego, en el ensayo de abejas enjauladas, las abejas jóvenes tuvieron acceso ad libitum a la empanada de polen sin esterilizar. Dicho protocolo podría haber mejorado aún más la supervivencia general, al proporcionar a las abejas proteínas y otras cepas bacterianas. Además,Corby-Harris y col. (2016) usaron abejas jóvenes de primavera de las colmenas de invierno para su experiencia en jaulas, mientras que nosotros usamos abejas de invierno. En conjunto, la mayor carga de esporas de Nosema combinada con una menor concentración de candidatos a probióticos y la falta de suministro de proteínas en el presente trabajo, probablemente explican la ausencia de disminución de la carga de esporas. Sin embargo, los cuatro candidatos probióticos mejoraron significativamente la supervivencia de las abejas en un 20-40%. Aunque todavía no es posible establecer si los efectos probióticos podrían interferir directa o indirectamente con la actividad funcional de Nosema , es razonable suponer que el efecto probiótico permite que las abejas melíferas toleren mejor las altas cargas de esporas de Nosema . Interacción funcional de N. ceranaecon miel de abeja se investigó esencialmente enfocándose en la regulación enzimática involucrada en el proceso de desintoxicación, la respuesta inmune y la actividad del metabolismo. A nivel de expresión génica, el intestino medio de las abejas melíferas respondió a la infección por N. ceranae aumentando la vía del estrés oxidativo con la síntesis concurrente de moléculas antioxidantes, de defensa y protectoras ( Dussaubat et al., 2012 ; Di Pasquale et al., 2013 ). A nivel proteómico, se midió la abundancia diferencial de proteínas asociadas con el metabolismo, la respuesta al estrés oxidativo y la apoptosis entre las abejas melíferas sensibles y resistentes ( Kurze et al., 2016) Otros estudios se centraron en otros mecanismos genéticos como el microARN, que se sospechaba que regulaban los genes relacionados con el metabolismo de las abejas melíferas hospedadoras en respuesta a la infección por N. ceranae ( Huang et al., 2015 , 2016 ). En general, la salud de las abejas melíferas es un sistema complejo que resulta de una combinación de redes de interacción funcional entre el huésped de la abeja, los microorganismos intestinales simbióticos ( Anderson et al., 2011 ) y los patógenos ( Schwarz et al., 2015 ). A este respecto, los microorganismos intestinales simbióticos desempeñan un papel central en la modulación de las reservas de energía y el desarrollo del sistema inmunitario, que son actores clave para las defensas del huésped contra los parásitos ( Habtewold et al., 2017 ; Knutie et al., 2017) Los mecanismos de resistencia inmunitaria pueden prevenir la invasión de parásitos y patógenos o eliminarlos después de la invasión. Contrariamente a los mecanismos de resistencia, los mecanismos de tolerancia inmune implican principalmente una menor capacidad de respuesta a un estímulo inmunitario dado, y el inicio de procesos de reparación de tejidos para proteger al huésped del daño causado por el patógeno ( Habtewold et al., 2017 ). La tolerancia de las abejas melíferas con respecto a las esporas altas de N. ceranae se documentó en Huang et al. (2012), donde las tasas de mortalidad más bajas se correlacionaron con una respuesta inmune regulada por aumento en colonias tolerantes de abejas el día 6 después de la infección, en comparación con los grupos de control. Por lo tanto, un equilibrio entre la resistencia inmune y los mecanismos de tolerancia garantiza la protección contra parásitos y / o patógenos y, al mismo tiempo, limita la inflamación del tejido que puede surgir como resultado de la producción excesiva de efectores inmunes. Como ahora se sospecha que la microbiota del huésped está completamente involucrada en los mecanismos de resistencia y tolerancia ( Vitetta et al., 2016), vale la pena revisar los efectos profilácticos y curativos conocidos de ambas cepas probióticas comerciales probadas en el presente estudio. Las cepas comerciales se administran a un amplio panel de organismos huéspedes como aditivos alimentarios para aumentar el rendimiento zootécnico mejorando tanto el metabolismo como la respuesta inmune ( Denev et al., 2013 ; Schoster et al., 2013 ; Hou et al., 2015 ). A este respecto, Bactocell ® ( P. acidilactici ) se demostró para ejercer una acción protectora mediante la estimulación de la actividad intestinal células de la mucosa que induce una respuesta positiva del sistema inmune de la tilapia ( Oreochromis niloticus; Standen et al, 2013.) En general, la administración de bacterias del ácido láctico (LAB) actúa como un inhibidor de la propagación de infecciones bacterianas al activar el sistema inmunitario del huésped ( Servin, 2004 ). Curiosamente, se observó en mamíferos que la administración de LAB tiene el potencial de alterar la diversidad microbiana intestinal, afectar la función de barrera intestinal y modular la respuesta inmune innata (p. Ej., A través de la regulación de la vía NF- κ B ) al aumentar la función de barrera mucosa, lo que conduce a una disminución en la translocación de bacterias y una disminución posterior en la capacidad de las bacterias patógenas para adherirse a la mucosa intestinal ( Reiff y Kelly, 2010 ). Como insectos y mamíferos comparten el mismo NF- κ Bmediada por la inducción de la inmunidad innata ( Hoffmann et al., 1999 ), uno de los supuesto mecanismo subyacente mejora la supervivencia habría que Bactocell ® ( P. acidilactici ) puede ejercer un efecto sobre el sistema inmunológico abeja de la miel en sí en lugar de directamente interferir con Nosema actividad . Entonces, puede estar involucrado otro mecanismo que favorezca la supervivencia de las abejas melíferas. Las bacterias del ácido láctico (LAB) producen moléculas antimicrobianas activas como bacteriocinas, antibióticos, peróxido de hidrógeno, por nombrar algunas. Esas moléculas excretadas pueden controlar el crecimiento y / o supervivencia de los microorganismos circundantes, incluidos virus, bacterias, levaduras, hongos y parásitos protozoarios ( Cleusix et al., 2007) Además, al reducir el pH intestinal local con ácido láctico, los LAB pueden inhibir el crecimiento de organismos sensibles al ácido ( Wohlgemuth et al., 2010 ). Las cepas de Saccharomyces cerevisiae boulardii , a las que pertenece Levucell SB ® , son levaduras no patógenas que han demostrado su eficacia experimental en la prevención y curación de enfermedades con un componente inflamatorio predominante, lo que indica que este probiótico podría interferir con las vías de señalización celular inducidas por la inflamación ( Palma et al., 2015 ) Las cepas de Saccharomyces cerevisiae boulardii tienen una amplia acción antipatógena, debido a su perfil molecular de la superficie externa, que se adhiere a bacterias patógenas como Escherichia coli ySalmonella . Además, S. cerevisiae boulardii puede competir eficazmente y desplazar cepas de levadura parásitas como la Candida ( Tomičić et al., 2016 ). S. cerevisiae boulardii también produce sustancias antifúngicas como los ácidos cáprico, caprílico y caproico, que se demostró que inhiben el crecimiento de levaduras patógenas en su entorno cercano. Finalmente, S. cerevisiae boulardii promueve la secreción de moléculas inmunes (p. Ej., IgA), que disminuyen la acción de las vías de citocinas proinflamatorias generadas en respuesta a bacterias patógenas, toxinas y antígenos ( Qamar et al., 2001 ). Aunque se sabe poco sobre la eficacia de S. cerevisiae boulardiicontra los parásitos protozoarios, tres estudios documentaron un efecto significativo de este probiótico contra la amebiasis ( Dinleyici et al., 2009 ), la giardiasis ( Besirbellioglu et al., 2006 ) y la infección por Blastocystis hominis ( Dinleyici et al., 2011 ). Finalmente, Lee et al. (2007) documentaron la combinación de P. acidilactici y S. cerevisiae boulardii en la coccidiosis. Sin embargo, el mecanismo molecular queda por caracterizar.

En general, los estudios experimentales sobre la acción probiótica bacteriana y de levadura contra parásitos que implican la secreción de un principio activo que puede inhibir el desarrollo del parásito solo se documentaron para Cryptosporidium, Giardia y Eimeria , aunque la naturaleza molecular del componente activo aún no se ha identificado ( Travers et al., 2011 ).

Conclusión

Este estudio confirma el potencial de las cepas endógenas aisladas de la abeja melífera como candidatos probióticos eficientes para mejorar la supervivencia de las abejas melíferas. Entonces, podemos concluir que la mortalidad de las abejas no estaba directamente relacionada con esporas  N. ceranaecargas. Además, como la duración del experimento fue lo suficientemente mayor como para cubrir hasta dos ciclos de vida del parásito (6 días), sugiere fuertemente que las cuatro cepas probióticas no ejercieron un efecto antagonista directo sobre el desarrollo del parásito. Nuestros resultados, combinados con los efectos probióticos documentados previamente de cepas relacionadas con nuestros cuatro candidatos, sugieren que el mecanismo de acción está más relacionado con la tolerancia, en lugar de la resistencia contra el parásito, potencialmente mejorando el sistema inmunológico y los procesos de reparación de tejidos para proteger al huésped. del daño causado por el parásito. 

Además, nuestros resultados, combinados con los otros ensayos experimentales de infección con N. ceranae sugieren que tanto NosemaLos títulos inoculados y las concentraciones de cepas probióticas deben tenerse en cuenta para interpretar adecuadamente los resultados, ya que los diferentes mecanismos de tolerancia o resistencia están potencialmente involucrados. Finalmente, estos resultados preliminares alentadores para los cuatro candidatos a probióticos se obtuvieron in vivo con aportes nutricionales mínimos (p. Ej., Sin proteínas); por lo tanto, la validación in situ es necesaria para evaluar completamente el potencial de estos candidatos a probióticos como herramientas preventivas y curativas sostenibles contra la nariz.

Definitivamente se necesitan estudios extendidos para comprender los mecanismos subyacentes a la interacción funcional entre la abeja melífera, su microbiota, la cepa probiótica y el parásito. El enfoque metatranscriptómico, que consiste en nuestro caso para medir el nivel de expresión génica de todos los organismos que habitan en el microbioma intestinal de las abejas melíferas, incluidas las células epiteliales del huésped, es sencillo para comprender mejor los mecanismos moleculares que subyacen a la mejora de la supervivencia de las abejas melíferas.

Contribuciones de autor

PG y ND escribieron la subvención, concibieron los experimentos, supervisaron todos los experimentos y escribieron el manuscrito; SE realizó análisis de datos, cultivos bacterianos, identificación molecular de cepas endógenas y escribió el manuscrito; AR realizó los ensayos de abejas enjauladas y escribió el manuscrito; AL realizó recuentos de esporas de Nosema y análisis estadísticos; BC supervized análisis estadísticos; SB realizó análisis bioinformáticos para identificar cepas probióticas endógenas y diseñó cebadores para la detección por PCR; VD y MC proporcionaron su experiencia en el desarrollo de probióticos a lo largo del proyecto y coescribieron el manuscrito; P-LM participó en todos los pasos de los protocolos de biología molecular (disección de abejas, extracción de ADN, PCR, secuenciación) y cultivos probióticos.



Sarah El Khoury  , Andrée Rousseau  , Alexandre Lecoeur 3 , Bachar Cheaib 1 , Sidki Bouslama 1 , 

Pierre-Luc Mercier 1 , Vanessa Demey 4 , Mathieu Castex 4 , Pierre Giovenazzo 1,2  y Nicolas Derome 

  • 1 Département de Biologie, Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes, Université Laval, Québec, QC, Canadá
  • 2 Apicole de producción, Centre de Recherche en Sciences Animales, de Deschambault, Québec, QC, Canadá
  • 3 UFR Sciences du vivant – Université Paris Diderot, París, Francia
  • 4 Lallemand SAS, Blagnac, Francia



Fondos

Este trabajo fue financiado con el programa Agro-Innovación de Agriculture and Agri-Food Canada. Número de subvención: 14-AP-247.

Declaracion de conflicto de interes

Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Expresiones de gratitud

Los autores agradecen a Agriculture and Agri-Food Canada (programa AgriInnovation PAI-P199) y a Lallemand Inc. por financiar este estudio, así como al Centro de investigación en ciencias animales de Deschambault, Laval University y el Institute for Integrative and Systems Biology ( IBIS). Los autores también desean agradecer a Amélie Bégin, Pierre Mermoz por la asistencia de laboratorio.

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Palabras clave: abeja melífera, parásito intracelular, Nosema ceranae , probióticos endógenos, interacción huésped-parásito.

Cita: El Khoury S, Rousseau A, Lecoeur A, Cheaib B, Bouslama S, Mercier PL, Demey V, Castex M, Giovenazzo P y Derome N (2018) Interacción nociva entre las abejas melíferas (Apis mellifera ) y su parásito intracelular microsporidiano Nosema ceranae se mitigó administrando cepas endógenas o alóctonas de microbiota intestinal. Frente. Ecol. Evol . 6:58. doi: 10.3389 / fevo.2018.00058

Recibido: 29 de septiembre de 2017; Aceptado: 20 de abril de 2018;
Publicado: 23 de mayo de 2018.

Editado por:David Georges Biron , Centro Nacional de Investigación Científica (CNRS), Francia

Revisado por:Cedric Alaux , INRA Centre Provence-Alpes-Côte d’Azur, Francia
Andone Estonba , Universidad del País Vasco (UPV / EHU), España

Copyright © 2018 El Khoury, Rousseau, Lecoeur, Cheaib, Bouslama, Mercier, Demey, Castex, Giovenazzo y Derome. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de Creative Commons Attribution License (CC BY) . El uso, distribución o reproducción en otros foros está permitido, siempre que se acredite al autor original y al propietario de los derechos de autor y se cite la publicación original en esta revista, de acuerdo con la práctica académica aceptada. No se permite el uso, distribución o reproducción que no cumpla con estos términos.

* Correspondencia: Nicolas Derome , nicolas.derome@bio.ulaval.ca